[发明专利]一种利用卵泡抑素Follistatin促进绵羊体外胚胎发育的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用卵泡抑素Follistatin促进绵羊体外胚胎发育的方法。

背景技术

卵泡抑素(Follistatin)是1987年由Robertson和Ueno分别从牛和猪的卵泡液中分离出的一种富含半胱氨酸的糖基化单链多肽。它可以通过与activin蛋白的结合抑制促卵泡激素的分泌。卵泡抑素不仅可以阻碍activin蛋白的作用，还能降低包括myostatin(MSTN)、GDF-9、bone morphogenetic proteins(BMPs)在内的其它TGF-β家族成员功能的发挥。通过与这些TGF-β家族成员的结合，卵泡抑素广泛参与了生物体多种生理功能的调控，包括繁殖、生长发育、神经诱导、渗透压调节、肌细胞生成和免疫调节。但目前，还没有Follistatin对绵羊体外胚胎培养发育影响的报道。

发明内容

本发明的目的在于：利用卵泡抑素Follistatin对绵羊卵母细胞体外受精后的早期胚胎进行处理，找到一种促进绵羊体外胚胎发育的方法。

实现本发明的目的技术方案如下：一种利用卵泡抑素Follistatin促进绵羊体外胚胎发育的方法，该方法步骤如下：(1)在绵羊屠宰场获取宰杀后30分钟以内的绵羊卵巢，置入温度在30-35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3-5小时内用生理盐水清洗3-4次；(2)然后，用吸有2ml抽卵液注射器抽吸卵巢表面2-5mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液置于器皿中，在显微镜下捡出卵母细胞，用体外成熟液洗涤3-5次，备用；(3)将步骤(2)中选择的卵母细胞，在条件为5％CO₂，95％空气，温度为38.6℃的CO₂培养箱内培养22-24小时，用绵羊体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴的密度加入装有体外受精液的液滴内，备用；(4)将解冻后的冻精，放入装有体外受精液的试管底部，CO₂培养箱内上游20-25分钟，取上层精子混悬液，以1500转/分钟的转速离心4-5分钟弃去上清液，用剩余的精子沉淀进行密度计算，按2-4×10⁶个/ml的密度加入步骤(3)的体外受精液滴，与卵母细胞共同孵育；(5)将步骤(4)中受精20-22小时的早期胚胎取出，移至含有10μg/L Follistatin的体外培养液IVC1内洗涤3-4次，并再次培养24-26小时；(6)将步骤(5)中在IVC1内培养24-26小时后的胚胎取出，再用常规的体外培养液IVC2洗涤3-4次，统计卵裂率，并继续培养，144-168小时后统计囊胚率。

所述的抽卵液为：TCM199-hepes+1mg/ml PVA+0.7mg/ml肝素钠；

体外成熟液(IVM)为：TCM199-HCO₃+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml雌二醇+24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素；

体外受精液(IVF)为：SOF+20％FBS+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素；

体外培养液1(IVC1)为：SOF+3mg/ml BSA+10μg/L Follistatin；

体外培养液2(IVC2)为：SOF+3mg/ml BSA；

其中所述合成输卵管液(SOF)为：6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml KCL+0.162mg/ml KH₂PO₄+0.6ul/ml乳酸钠+0.089mg/ml MgSO₄+2.1mg/ml NaHCO₃+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/ml CaCL₂·2H₂O。

有益效果：通过卵泡抑素Follistatin对绵羊卵母细胞体外受精后的早期胚胎进行处理，能显著提高体外胚胎发育囊胚率。为科研生产实践探索出一条新的生物学方法。

具体实施方式