[发明专利]一种基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法，属于核酸检测技术领域。

背景技术

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子双链拷贝。类似于DNA的天然复制过程，DNA链式聚合反应(PCR)聚合酶链反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，就可获得更多的“半保留复制双链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR因其特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等优点而被广泛应用。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA，RNA的地方，它也是目前核酸检测的金标准。PCR双链产物的检测方法一般包括琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶切、测序等，最后借助染色和紫外透射成像进行分析。这些分析操作步骤繁琐、耗时长，且依赖仪器及特殊训练的专业人员。因此，寻找准确、快速、灵敏、低成本、操作简易的检测PCR产物方法尤其重要。现有很多技术可以达到快速、高通量的检测基因的目的，例如胶体金核酸试纸条、芯片平台，但是都是基于核酸单链间的碱基互补配对杂交而实现的，因此产生单链PCR产物对于快速检测是至关重要的。因此，如果可以将PCR产物加上一个单链核酸标签Tag的话，就可以用胶体金核酸试纸条、基因芯片等对PCR产物进行检测，达到准确、快速、灵敏、低成本、操作简易的检测需求。现有的对PCR产物加Tag方法依赖以下两种技术：化学修饰小分子及蛋白或者偶联纳米粒子。但这两种技术方案中以化学小分子或者蛋白为Tag，虽然可以实现快速检测，但是在合成核酸时需要额外支付修饰费用，而且在T线和C线上需要固定抗体，价格昂贵，增加了检测的成本；而利用高温变性产生单链Tag用于杂交，这种技术方案产生Tag的方法也依赖多重修饰才能用试纸条进行夹心法检测，修饰操作复杂，且在试纸条上固定的也是蛋白或者抗体，价格比核酸高，并且需要通过变温来产生单链，效率低，影响检测灵敏度。因此，为解决以上问题，亟待研发一种新的基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为解决上述问题，本发明提出了一种基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法，简便、快速、低成本、可通用的核酸检测方法。

(二)技术方案

本发明的基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤一：设计用于扩增目的基因的引物序列，并且给两条序列加上Tag便签序列，两段序列中间用偶氮苯隔开作为修饰；

步骤二：设计用于检测两条Tag标签序列的胶体金核酸试纸条所需序列；

步骤三：按照步骤二的设计要求，将核酸标记胶体金，并制备胶体金核酸试纸条；

步骤四：混合PCR反应体系，并将混合后的PCR反应体系放入PCR仪进行反应；

步骤五：利用胶体金核酸试纸条检测PCR产物。

进一步地，所述步骤一具体如下：根据待测Target序列设计上下游引物，并在设计好的序列段中分别加入Tag1和Tag2序列，形成的PrimerF/R包含一个偶氮苯(X)。

进一步地，所述步骤二具体如下：设计标记胶体金的序列，通过巯基SH修饰，从而与胶体金通过金硫键Au-S结合，与Tag1互补；设计与Tag2互补的序列，用于固定在T线区域；设计与标记胶体金序列互补的序列，用于固定在C线区域。

进一步地，所述步骤三具体如下：将制备好的核酸-金标记物用划膜喷金仪喷在玻璃纤维膜上(金标垫)；并将T-lineDNA和C-lineDNA用划膜喷金仪划在硝酸纤维素膜上，构成检测区和质控区；把样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫分别组装在PVC板上，每个部分重叠2mm，保证层析过程顺利进行；将组装好的试纸条用自动斩切机，切割成3mm宽。

进一步地，所述步骤五具体如下：将PCR产物滴加到样品垫上；缓慢滴加上样缓冲液，让样品在胶体金核酸试纸条上缓慢前行，5分钟后，观察结果。

(三)有益效果