[发明专利]一种快速检测禽源样品中沙门菌的LAMP试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种快速检测禽源样品中沙门菌的LAMP试剂盒，具体为一种快速检测禽源样品中鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌与肠炎沙门菌的LAMP试剂盒。

背景技术

沙门菌(Salmonella)是肠杆菌科中最常见的人畜共患病原菌，常寄生于动物和人体肠道内。由沙门菌引起的食物中毒是所有细菌性食物中毒中比例最高，危害最广的一种。沙门菌感染的禽群，是那些能够通过食物链传给人的沙门菌最为常见的储存库之一。从家禽和禽产品中分离出沙门菌的报道明显多于其它动物，造成这一结果的主要原因是由于沙门菌在被感染的家禽中能通过水平传播和垂直传播造成广泛流行，同时也反映出家禽的饲养数量十分庞大。大量的研究数据表明，不同宿主来源的沙门菌血清型存在较大的差异，对禽源沙门菌的流行病学研究表明，其优势血清型主要集中于鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、肠炎沙门菌等几种严重危害家禽养殖业与人类健康的血清型，因而针对上述禽源优势血清型沙门菌开发特异性的检测技术对于防控禽源沙门菌的传播具有重要的意义。

由于传统的沙门菌检测技术上存在诸多缺陷，如：操作步骤烦琐耗时，现行的国家标准或行业标准中对沙门菌的检测通常需要4-6天，已不能满足及时有效的质量监测和疾病防控需求；灵敏度较低，当样品中沙门菌含量较低时，易造成假阴性结果；准确度不高，尤其是加工后的食品受加热、干燥、高盐和冷冻等因素的作用，易导致沙门菌形成营养缺陷型，用传统方法不易检出。因此，迫切需要研发操作简便、准确快速的检测技术。环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新型的分子检测方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用链置换型DNA聚合酶，能在等温条件下(60～65℃)、1h内特异地扩增出10⁹～10¹⁰拷贝靶序列。在保持传统PCR技术优点的基础上，进一步提高了反应的特异性，同时缩短了检测时间。现已被应用于多种病原微生物的检测和研究，并具有良好的发展前景。

发明内容

本发明针对现有沙门菌检测技术上存在诸多缺陷，旨在提供一种简单、快速、准确的检测禽源样品中沙门菌的LAMP试剂盒，该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、操作简单的特点。

本发明另一目的在于提供一种用于检测沙门菌的通用LAMP引物组。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种快速检测禽源样品中沙门菌的LAMP试剂盒，包括：

1)10×LAMP缓冲液；

2)8000U/mL BstDNA聚合酶；

3)10mM dNTPs；

4)LAMP引物组：外引物浓度为5pmol/μL，外引物为F3和B3；内引物浓度为40pmol/μL，内引物为FIP和BIP；环引物浓度为20pmol/μL，环引物为LF和LB；

5)无菌去离子水；

6)荧光染料：10×SYBR Green I；

7)阳性对照：肠炎沙门菌标准株ATCC13076基因组DNA；

8)阴性对照：无菌去离子水。

所述的10×LAMP缓冲液含有200mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁、8M甜菜碱和体积百分浓度为1％的曲拉通X-100。

所述的外引物F3和B3序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述的内引物FIP和BIP序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述的环引物LF和LB序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本发明待检样品基因组DNA按常规方法提取或试剂盒提取。

本发明试剂盒LAMP检测反应体系为：每25μL反应液中，5pmol/μL的F3和B3各1μL，40pmol/μL的FIP和BIP各1μL，20pmol/μL的LF和LB各1μL，Bst DNA聚合酶1μL，10mmol/L的dNTPs 3.5μL，待检样品DNA 2～3μL，无菌去离子水适量。

本发明试剂盒采用荧光目视法时，需在反应体系中添加10×SYBR Green I 2.5μL，反应体系总量保持25.0μL不变。

本发明LAMP反应条件为：66℃恒温反应50min，并在80℃持续10min。

本发明所述的沙门菌为鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌或肠炎沙门菌中的一种或几种。