[发明专利]新特性腈水合酶诱导的高含量烟酰胺合成

说明书

技术领域

本发明属微生物技术领域。具体涉及一种新特性腈水合酶催化法生产烟酰胺的方法。

背景技术

烟酰胺又称尼克酰胺，属B族微生物，是全球14种维生素中第二大维生素，在当前的使用量仅次于维生素E，目前全球年使用量达60000吨。烟酰胺主要存在于动物体内，临床治疗用的多为合成品。缺乏烟酰胺会影响细胞的正常呼吸和代谢，从而产生糙皮病、口炎、舌炎、肝脏疾病以及日光性皮炎。大剂量的烟酰胺可降低胆固醇和甘油三酯的量，其生理作用与盐酸相仿，但水溶性较好，无明显扩张血管作用。广泛应用于医药、食品、饲料、化妆品、化工等行业中。

目前烟酰胺生产工艺有化学法和微生物法。化学法采用的是以3-甲基吡啶、2-甲基-1,5-戊二胺、喹啉等为原料，通过氧化剂直接氧化或催化氧化生成3-氰基吡啶，再经过碱液水解生产烟酰胺。该工艺较成熟，但需加催化剂、高温、多步反应，且反应后所得的反应液含量不高，组分不纯，不利于提取。生物催化法是采用微生物细胞中产生的腈水合酶转化3-氰基吡啶生成烟酰胺。微生物法生产烟酰胺具有反应条件温和，流程简单，产物产率和纯度高等优点，这些都是化学合成法所不可比拟的。因而微生物法日益受到研究者的关注。

美国专利（USA4008241）采用化学法，以3-氰基吡啶在氨水溶液作用下制备烟酰胺。该反应温度90-150℃、反应时间4-8 h，其3-氰基吡啶的最大转化率仅70%。且需通过多步分离过程将未转化的3-氰基吡啶和氨于产物烟酰胺分离，成本高，产物不纯；美国专利（USA1133013）同样采用化学法，用二氧化锰进行腈类的催化水合反应，所得烟酰胺收率仅79.28%，且具有原料毒性大、反应所需催化剂量高等缺点。

中国专利（CN1424402A）报道了一种微生物催化法生产烟酰胺的方法，其采用丙酸棒杆菌的腈水合酶将3-氰基吡啶转化成烟酰胺，避免了使化学法催化剂使用量大且反应步骤多的特点，但产酶细胞的制备较为繁琐；中国专利（CN101712944B）报道了以3-氰基吡啶为底物，以枯草芽孢杆菌为生物催化剂，采用底物和生物催化剂耦合补加的方式进行催化水合反应得烟酰胺，所得烟酰胺的纯度不高，仅在98%左右。  

    本发明人通过大量的实验筛选和优化，确定了合适的微生物种类及其催化方法，克服了上述问题，使得烟酰胺的纯度和收率大大提高，且得到的烟酰胺用简单常规的后处理纯度即可达99.9%以上。

发明内容

    为了弥补现有技术的不足和缺陷，本发明的目的在于提供一种烟酰胺的生产方法，采用具有优异协同作用的二元复合腈水合酶，同时反应体系中引入一定浓度的助溶剂，有效的提高了产品的纯度和收率。合成方法操作简单、高效、环境友好、损失小。

为了实现上述目的本发明采用的技术方案如下：

新特性腈水合酶诱导的高含量烟酰胺合成的方法，其特征在于：采用的是二元复合腈水合酶，该复合酶是由白被芽孢杆菌和红球菌组合培养产生，具体合成方法：

 将甘油管保存的白被芽孢杆菌和红球菌接种到适用于白被芽孢杆菌和红球菌的培养基中进行发酵培养，然后对发酵液进行纱布清洗，得到菌体，将菌体细胞或处理过的菌体细胞添加到含有3-氰基吡啶溶液中进行水解反应，最后对转化液进行分离，即得烟酰胺。

 所述的新特性腈水合酶诱导的高含量烟酰胺合成方法，其特征是，包括以下步骤：

    （1）种子培养：种子培养基组成：0.5～8%甘油，0.2～8%酵母膏，0.05～0.5%NaCl，0.05～0.5% K₂HPO₄，0.05～0.5% MgSO₄，0.1～1%尿素，用去离子水配制，pH适中；取种子培养基，分装三角瓶中，灭菌，然后接入菌种白被芽孢杆菌和红球菌，摇床转速80~450 r/min，在15~50℃摇床培养25~85h作为种子液，备用；

（2）发酵培养：发酵培养基组成：1～8%甘油，0.1～5%的葡萄糖或蔗糖，0.2～3%酵母粉，0.1～5%的尿素， 0.05～0.8% K₂HPO₄， 0.05～0.8% MgSO₄，1～30ppm CoCl₂，用去离子水配制，将发酵培养基分装、灭菌，接入种子液，pH 6.5～8.5，温度20~80℃下培养10～25 h；