[发明专利]一种双酶敏感型荧光探针及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及化学分析，生物分析，临床医学检测领域，属于有机小分子荧光探针技术领域。

背景技术

基质金属蛋白酶是一类细胞外基质组分的蛋白酶，在疾病的病理损害中扮演重要作用。基质金属蛋白酶的表达和活性受到诸如细胞因子、激素等的严格调控，并且受到其天然抑制剂的抑制，基质金属蛋白酶的过度表达会引起诸如肿瘤入侵和转移等疾病，因此，对于基质金属蛋白酶的检测及其活性鉴别有利于对早期肿瘤等疾病的诊断和检测。

凋亡酶是一种半胱氨酸水解酶，在启动和执行细胞凋亡信号过程中扮演重要角色。凋亡酶在细胞内以非活性的形式存在，当遇到凋亡刺激信号以后，通过细胞内的蛋白水解作用实现其向具有生理活性的结构转变，从而调控细胞程序死亡。与此同时，大部分的肿瘤治疗药物都具有凋亡相关的机制，因此，凋亡酶的检测有利于早期肿瘤治疗效果的评价、推进和优化肿瘤治疗方案。

能量共振转移是激发态的给体荧光基团通过偶极作用，以非辐射过程将能量传递给邻近的受体荧光基团，转化为其他能量，当不以荧光发射的方式释放能量时，荧光淬灭。但当荧光基团之间的距离超过能量共振转移的范围时，能量共振转移现象消失，从而恢复激发态给体回到基态时发射的荧光。正由于这种能量共振转移距离敏感的特性，被广泛应用于生物大分子、动态过程等的监测。

多肽是一类生物相容性良好的具有特定生物活性的物质，通过一定氨基酸按照一定的序列组成的结构可以被相关的酶特异性的识别和切断，被广泛运用到生物分子的检测、疾病的诊断以及药物的运输。采用多肽固相合成技术，可以实现对目标分子的有效合成及分离，并且，多样化的氨基保护可以实现对多肽的多功能化修饰，从而满足不同的检测和分析等需求。

目前，针对凋亡酶或者基质金属蛋白酶的荧光探针被广泛设计和利用。但常用的荧光探针都只针对某一种酶而设计，由于生物体系复杂性对特异性酶检测的干扰，酶对特异性多肽序列的识别能力有限，以及现阶段对肿瘤诊断及治疗效果评价为一体的多功能荧光探针的需求，针对双酶敏感而设计的荧光探针具有重大的应用价值，并且，双能量共振转移荧光淬灭过程可以实现对荧光分子荧光的有效淬灭，从而提高探针的信噪比，能极大地增大荧光探针的特异性检测能力和应用范围。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测基质金属蛋白酶和凋亡酶的荧光探针及其合成方法和应用。

本发明提供的检测基质金属蛋白酶和凋亡酶的荧光探针，即双酶敏感型荧光探针，包含凋亡酶特异性识别多肽序列、基质金属蛋白酶特异性识别多肽序列和两对能量共振转移的分子荧光对。

所述的两对能量共振转移分子荧光对的给体为同一给体。

所述的分子荧光对是以荧光素为同一给体和以不同二甲氨基偶氮苯为受体的荧光淬灭分子荧光对。

所述的凋亡酶特异性识别多肽序列为包含氨基酸-氨基酸-氨基酸-天冬氨酸的多肽序列；所述的基质金属蛋白酶特异性识别多肽序列为脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸、脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸、脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-赖氨酸-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酰胺中的一种。

所述的包含氨基酸-氨基酸-氨基酸-天冬氨酸的多肽序列为天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸或色氨酸-谷氨酸-组氨酸-天冬氨酸。

进一步地，所述的双酶敏感型荧光探针优选为，化学名为二甲氨基偶氮苯-甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-赖氨酸(荧光素)-丝氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-赖氨酸-二甲氨基偶氮苯，化学结构如式(Ⅰ)所示：

式(Ⅰ)所示结构的双酶敏感型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(A)合成二甲氨基偶氮苯-甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘氨酸、荧光

素-赖氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-赖氨酸-二甲氨基偶氮苯；

(B)将二甲氨基偶氮苯-甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘氨酸与荧光素-赖氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-赖氨酸-二甲氨基偶氮苯进行片段缩合，即得到式(Ⅰ)所示的检测基质金属蛋白酶和凋亡酶的荧光探针。

所述的步骤(A)中，二甲氨基偶氮苯-甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘氨酸和荧光素-赖氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-赖氨酸-二甲氨基偶氮苯的合成采用多肽固相合成方法；