[发明专利]抗副溶血弧菌OMPK卵黄抗体制备及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物制品制备技术领域，具体地涉及一种抗副溶血弧菌ompk卵黄抗体的制备及其快速检测应用，可用于副溶血弧菌引起的水生动物疾病的检测。

背景技术

近年来，随着海水养殖规模的不断扩大，病害频繁发生，成为制约养殖业健康发展的主要瓶颈之一，其中尤以弧菌病最为严重。业已证实，副溶血弧菌等是海水养殖动物的主要病原弧菌，同时也关系到水产品质量安全。然而，国内还缺乏成熟的弧菌快速检测手段以满足对水产疾病控制和水产品安全，特别是早期诊断技术和手段。目前，国内外已经开展了大量弧菌病免疫检测技术的研究，但是大多是采用全菌苗制备多克隆抗体或多克隆抗体而建立的快速检测方法，目前，国内外已经开展了大量弧菌病免疫检测技术的研究，但是大多是采用多克隆抗体而建立的快速检测方法，存在交叉反应、特异性和灵敏性等方面的缺陷，而卵黄抗体具有不同于哺乳动物抗体的特殊生物学特性，尤其是由亚单位疫苗制备的卵黄抗体具有更好的特异性和灵敏性，在水产动物致病弧菌的快速检测中具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体制备方法，并作为诊断抗体建立检测副溶血弧菌的ELISA方法，用于副溶血弧菌的检测与防治。

本发明是通过如下技术方案来实现的

一种抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体制备方法，利用副溶血弧菌重组ompk蛋白对蛋鸡进行接种免疫，对接种后的鸡所产的鸡蛋在除去蛋白后用蒸馏水漂洗得到纯卵黄液，对纯卵黄液进行离心、收集上清液，应用饱和硫酸铵溶液沉淀法制备粗制的卵黄抗体，再应用凝胶层析柱进一步纯化，获得精制抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体。

进一步，所述的副溶血弧菌重组ompk蛋白的制备方法，根据ompk基因序列设计引物，利用所述引物对抗副溶血弧菌的基因组DNA进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶分离并回收ompk片段，并用试剂盒纯化回收的ompk片段，将纯化后的ompk片段、原核表达载体pET28a进行双酶切，用T4连接酶连接ompk酶切回收产物和pET28a酶切回收产物，得到重组阳性质粒，将重组阳性质粒在BL21感受态细胞中诱导表达，表达产物利用柱层析进行纯化。

进一步，所述根据ompk基因序列设计引物：

上游引物vp1-ompk-28a-F：5’-CCGGAATTCTTCGGCGGTCGCTCTGG-3’

下游引物vp1-ompk-28a-R：5’-CGCGTCGACGAACTTGTAAGTTACTGC-3’(划线部分为SalI酶切位点)。

本发明还提供一种抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体间接ELISA方法，所述方法的最佳反应条件：抗原最适工作浓度浓度为1×10⁸cfu/mL，包被4℃过夜；一抗IgY稀释度为1:2⁸；IgY-HRP酶标抗体作1:20000稀释；选择底物的最佳反应时间为20min。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明用高纯度副溶血弧菌外膜蛋白ompk，与等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化，免疫健康海兰蛋鸡，每隔10天加强免疫1次，第3次加强免疫后1周 开始收集鸡蛋。鸡蛋在除去蛋白后用蒸馏水漂洗得到纯卵黄液，应用饱和硫酸铵溶液沉淀法制备粗体的卵黄抗体，再应用Sephadex G-200凝胶层析柱进一步纯化，所得样品经SDS-PAGE电泳检测，证实获得精制抗副溶血弧菌外膜蛋白ompk的卵黄抗体。本发明以精制抗副溶血弧菌外膜蛋白OMPK的卵黄抗体作为检测副溶血弧菌的快速检测方法，具有较高的专一性和特异性。

建立基于IgY的间接ELISA测定抗原浓度的技术方法，确定抗原包被浓度、一抗IgY和酶标二抗最适稀释倍数，抗原包被条件的选择，底物的最佳反应时间等间接ELISA的实验条件。用建立起来的间接ELISA检测几种常见的致病性海洋弧菌及常见细菌：副溶血弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。发现只能检测到副溶血弧菌，其他细菌皆为阴性，表现出了较高的特异性。

附图说明

图1重组OMPK的表达、纯化及Western blotting检测M:Marker 1:阴性对照 2:诱导前 3:诱导后 4:纯化的ompk，5:纯化的ompk蛋白Western blotting检测。