[发明专利]通用型基因打靶载体

说明书

本发明公开了一种通用型基因打靶载体，属于生物工程领域。该通用型基因打靶载体使用新霉素磷酸转移酶和EGFP为正选择标记，DsRed为负选择标记；正选择标记基因表达框的两侧各含有1个同向排列的LoxP位点；在LoxP位点附近各含有一段由稀有限制性内切酶位点组成的多克隆位点，便于基因打靶臂的克隆。该载体含有2个归巢限制性内切酶位点，分别为I‑CeuI和I‑SceI，可作为通用酶切位点将该载体线性化。本发明提供的通用型基因打靶载体，不仅具备单药物和双荧光筛选功能，而且其含有的LoxP位点可介导选择标记的高效删除反应，这为动物安全转基因技术提供了新材料，具有重要的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种通用型基因打靶载体。

背景技术

动物转基因技术在基因功能与信号通路解析、构建疾病动物模型、创制生物反应器以及家畜新品种培育等方面，有重要应用价值。动物转基因技术可以从分子手段、转移方式和细胞介质三个层面进行分类。分子手段主要是指修饰位点的特异性，包括非定点型和定点型两类。DNA随机整合、病毒介导、转座酶/子等是非定点型，其共同缺陷是无法对整合位点和拷贝数进行严格控制，外源基因的表达也难以预期，因此很难运用到转基因家畜育种上来。在这个背景下，各种定点型技术应运而生。定点型技术的发展又分为两个阶段。第一阶段是非双链断裂依赖型(double-stranded break independent,DBS-independent)，这主要是指传统基因打靶和位点特异重组酶家族。传统基因打靶依赖于同源重组，而自然条件下同源重组的频率很低，因此其可操作性不高。FLP/FRT、Cre/LoxP等位点特异重组系统介导可逆重组反应，这就决定其净效能仍然较低。第二阶段是双链断裂依赖型(double-stranded break dependent,DBS-dependent)，这主要是指近年来出现的ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活样因子核酸酶)和Cas9等新技术。它们的共同点是可在特异的靶位点造成双链断裂，而双链断裂诱发同源重组的频率将提高2-3个数量级，可操作性大为改善(Shamim HR et al.,2013)。从分子修饰技术的发展趋势和转基因家畜育种的实际要求来看，定点型技术将是未来应用的主流。

基因打靶过程中，如何提高中靶细胞的富集和筛选效率是一个难点。自然状态下，哺乳动物细胞内同源重组的概率不到10^-6，这在实际中几乎不具有操作性。后来，有研究者发展了“正负选择法”。正选择标记基因有新霉素磷酸转移酶(neo)、潮霉素B磷酸转移酶(hph)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶(gpt)、次黄嘌呤磷酸转移酶(Hprt)、胸腺嘧啶激酶(tk)及嘌呤霉素乙酰转移酶(puro)。负选择标记基因有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)、SacB、rpsl(strA)、tetAR、pheS、thyA、CacY、gata-I、ccdB等。同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。置换型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为neo基因，位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基因在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序列均保留(包括tk)。胸苷激酶蛋白(TK)可使无毒的丙氧鸟苷(GVC)转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。故同源重组时，G418和GVC都有抗性，随机整合时对G418有抗性，但对GVC敏感，细胞将被杀死，无整合的将被G418杀死。用G418作正筛选，选出含有neo基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株，保留未含有tk基因的同源重组细胞株。此方法是目前应用较广泛的一种策略。正向筛选标记基因Neo具有双重作用，一方面导致靶基因的插入突变；同时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长。