[发明专利]一种底物特异性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法

权利要求书

1.一种角蛋白酶突变体，其特征在于，是将来源于嗜麦芽窄食单胞菌的角蛋白酶的第215位的酪氨酸替换成丙氨酸，或者第180位的丝氨酸替换成甘氨酸同时将第215位的酪氨酸替换成丙氨酸；所述第180位、第215位的氨基酸均属于角蛋白酶KerSMD的S1口袋组成氨基酸；所述来源于嗜麦芽窄食单胞菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述角蛋白酶突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的载体或重组细胞。

4.一种获得权利要求1所述角蛋白酶突变体的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)将从嗜麦芽窄食单胞菌BBE11-1中获得的编码角蛋白酶的基因，克隆到pET22b(+)中，构建重组质粒pET22b+kerSMD；

(2)采用滚环PCR的方法，设计含有代表突变氨基酸的密码子碱基的互补引物，PCR扩增质粒pET22b+kerSMD得到含有编码角蛋白酶突变体的基因序列的开环重组载体；

(3)将含有编码正确突变体的基因的PCR反应液经过DpnI内切酶消化，除去未突变的原质粒，反应液直接转化感受态大肠杆菌JM109，挑取正确复制子，并提取正确突变质粒；

(4)将正确的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达，发酵上清液即角蛋白酶突变体粗酶液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还进一步包括使用AKTA蛋白纯化仪和HisTrap FF crude 1ml的镍柱对角蛋白酶进行纯化。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将步骤(4)获得的重组菌在含有100μg/L的氨苄青霉素的LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入含有100μg/L的氨苄青霉素的LB发酵液体培养基37℃培养至OD600＝0.6，降温至20℃培养，加入最终浓度0.1mM的诱导剂IPTG诱导，72h时离心获得上清酶液，即为粗酶液。

7.权利要求1所述角蛋白酶突变体在日化洗涤产品中的应用。

8.权利要求1所述角蛋白酶突变体在纺织领域的应用。

9.权利要求1所述角蛋白酶突变体在制备饲料中的应用。