[发明专利]一种底物特异性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种底物特异性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法，属于酶工程领域。

背景技术

角蛋白酶(Keratinase)为一种可以特异性降解角蛋白的酶类，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物产生。角蛋白酶在食品、医药、饲料、精化和制革等工业中广泛应用，具有嫩化肉类、生产高级营养品、免疫制剂和饲料添加剂以及美容、软化皮革等作用，并可导致疯牛病和人类克雅氏症的阮蛋白(Prion)的降解。虽然角蛋白酶有着巨大的应用和研究价值，但是从野生菌中筛选出的角蛋白酶热稳定性差，底物专一性不高，大大降低了角蛋白酶的开发和运用。目前已经报道的角蛋白酶基因主要来自国外的一株地衣芽胞杆菌的kerA基因。本发明将来自嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1的角蛋白酶KerSMD进行分子改造，提高角蛋白酶对酪蛋白或羽毛的底物专一性，对角蛋白酶的规模化生产及推广具有深远的技术指导意义。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种底物特异性提高的角蛋白酶突变体，是将来源于嗜麦芽窄食单胞菌的角蛋白酶的第180位的丝氨酸替换成甘氨酸，或者第208位的谷氨酸替换为丝氨酸，或者第215位的酪氨酸替换成甘氨酸或者丙氨酸或者丝氨酸或者苯丙氨酸，或者第180位的丝氨酸替换成甘氨酸同时将第215位的酪氨酸替换成丙氨酸或者丝氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述来源于嗜麦芽窄食单胞菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶突变体为第180位丝氨酸替换成甘氨酸的S180G。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶突变体为第208位谷氨酸替换为丝氨酸的E208S。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶突变体为第215位酪氨酸替换成甘氨酸或者丝氨酸或者丙氨酸的Y215G、Y215S、Y215A。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶组合突变体为第180位丝氨酸替换成甘氨酸和215位的酪氨酸替换成丙氨酸的S180G/Y215A。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶组合突变体为第180位丝氨酸替换成甘氨酸和215位的酪氨酸替换成丝氨酸S180G/Y215S。

本发明要解决的第二个技术问题是提供获得所述角蛋白酶突变体的方法，具体步骤如下：

(1)根据从嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1中获得编码角蛋白酶KerSMD基因，克隆到pET22b(+)中，构建重组质粒pET22b+kerSMD；

(2)采用滚环PCR的方法，设计中间含有突变氨基酸代表的密码子碱基的互补引物，PCR扩增质粒pET22b+kerSMD得到含有编码角蛋白酶突变体的基因序列的开环重组载体；

(3)将含有编码正确突变体的基因的PCR反应液经过DpnI内切酶消化，除去未突变的原来质粒，反应液直接转化感受态大肠杆菌JM109，挑取正确复制子，并提取正确突变质粒；

(4)将正确的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达，发酵上清液即角蛋白酶突变体粗酶液。

所述方法还进一步包括使用AKTA蛋白纯化仪和HisTrap FF crude 1ml的镍柱对角蛋白酶进行纯化。

将所述方法中步骤(4)获得的重组菌在含有100μg/L的氨苄青霉素的LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入含有100μg/L的氨苄青霉素的LB发酵液体培养基37℃培养至OD₆₀₀＝0.6，降温至20℃培养，加入最终浓度0.1mM的诱导剂IPTG诱导，72h时离心获得上清酶液，即为粗酶液。