[发明专利]一种新型筛选标记玉米丝氨酸消旋酶基因应用于烟草转化技术

权利要求书

1.一种用于烟草遗传转化筛选标记的基因，其特征为所述基因为玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR，序列为如序列表中SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR作为烟草遗传转化的筛选标记基因的应用。

3.包含如权利要求1所述的玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR的植物表达载体。

4.根据权利要求3所述的一种玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR的植物表达载体，其特征为用权利要求1所述的玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR替换双元表达载体pCAMBIA1301上的GUS标记基因。

5.一种制备权利要求4所述的植物表达载体的方法，其特征为步骤如下：

(1)以玉米B73自交系三叶期cDNA为模板克隆获得，根据NCBI网站公布序列(NM_001143028.1)设计引物，上游加NcoI(CCATGG)酶切位点，下游加Bstp I(GGTAACC)酶切位点，引物如下：

引物1(上游引物)：5’-CATGCCATGGATGGGAAGTAAAGACGGCACCGG-3’

引物2(下游引物)：5’-GGGTAACCTCAGTGTTTGTACATAGACTG-3’

(2)PCR得到约1000bp条带，回收后得回收产物A，将回收产物用Nco I和BstP I双酶切获得酶切之后的序列A；将pCAMBIA1301载体用Nco I和BstP I双酶切，回收线性化的pCAMBIA1301载体；用T₄连接酶连接得酶切之后的序列A和线性化的pCAMBIA1301载体获得重组载体，重组载体命名为pBI1301-ZmSR，即包含如权利要求1所述的玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR的植物表达载体pBI1301-ZmSR，pBI1301-ZmSR载体转入Trans5α感受态中获得转化菌株，将菌液送生工测序，得到结果与报道的序列一致，转入的基因为玉米丝氨酸消旋酶基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

酶切体系如下：

6.一种含植物表达载体pBI1301-ZmSR的农杆菌的制备方法，其特征为步骤如下：将验证正确的pBI1301-ZmSR载体通过液氮冻融法转化到农杆菌LBA4404中，用无菌牙签挑取YEP平板上的单菌落，接种于适量的含Kan(100μg/mL)、Rif(100μg/mL)的液体YEP培养基中，振荡培养过夜培养；对农杆菌LBA4404的质粒进行酶切鉴定确认，获得含pBI1301-ZmSR载体的农杆菌LBA4404。

7.权利要求3或4所述的植物表达载体作为表达烟草遗传转化的筛选标记基因的应用。

8.根据权利要求3或4所述的植物表达载体，其特征在于能以根癌农杆菌LBA4404作为宿主，导入到烟草叶片和愈伤组织中。

9.一种向烟草组织转入如权利要求1所述玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR的方法，其特征为步骤如下：

(1)以玉米自交系B73三叶期的cDNA为模板克隆得到的ZmSR基因序列，引入Nco I和Bstp I为上下游酶切位点，替换双元表达载体pCAMBIA1301上的GUS标记基因获得载体pBI1301-ZmSR，将载体pBI1301-ZmSR导入到根癌农杆菌LBA4404中；

(2)通过对烟草培养基条件的筛选，优化烟草叶片最佳诱导愈伤的培养基；

(3)对烟草叶片进行卡那霉素及D-丝氨酸的抗性敏感性试验，分别确定临界浓度；对烟草愈伤组织进行卡那霉素及D-丝氨酸的抗性敏感性试验，分别确定烟草愈伤组织的临界浓度；

(4)用农杆菌介导法将载体pBI1301-ZmSR分别转入到烟草叶片和愈伤组织中，并用卡那霉素及D-丝氨酸筛选，最分子检测由叶片和愈伤组织获得的抗性苗获得含玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR的植株。

10.一种向烟草组织转入如权利要求1所述玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR的方法，其特征为步骤如下：

(1)受体材料的预培养

将皖烟1号烟草叶片切成0.5cm×0.5cm的小块，接种在叶片不定芽诱导培养基MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6g/L上进行预培养7d，用于叶片转化材料；

(2)愈伤组织诱导效果的对比性试验

将皖烟1号烟草叶片切成0.5cm×0.5cm的小块，正面向上放置于培养基表面；培养基以MS为基本培养基，pH为5.8-6.2；附加蔗糖25g/L、琼脂6g/L；采用激素6-BA、2，4-D、NAA和KT处理，每个处理接种90片；

(3)工程菌制备

从-70℃冰箱取出实施例1制备的含质粒pBI1301-ZmSR的农杆菌，蘸取少量菌体，接种于含Kan 50mg/L，Rif 50mg/L的YEP平板上，于28℃遮光培养24h后，从活化平板上挑取单菌落接种于有抗生素的YEP液体培养基中，28℃，220rpm培养约24h，视菌液浓度用不含抗生素的YEP液体培养基按1:50的比例进行稀释，28℃220rpm振荡培养4-6h，至相应OD₆₀₀值时，4℃，5000rpm离心5min收集菌体，用相同体积的MS液体培养基(含AS，浓度为200μmol/L)悬浮备用；

(4)侵染与共培养

用含200μmol/L AS的MS液体培养基悬浮活化后的工程菌液，将预培养过的叶片及愈伤组织分别浸入菌液中摇晃30min后，将叶片及愈伤组织用无菌滤纸吸干接种到共培养培养基MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6g/L+AS 200μmol/L上，22℃遮光培养3d；

(5)菌的清洗

待培养基中长出可见菌落即可进行清洗，用无菌水洗叶片5-7次，再用含Cef400mg/L水浸泡，放入恒温摇床中振荡半个小时，用无菌滤纸吸干，分别接种到恢复培养基MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6g/L+Cef 400mg/L上，25℃左右遮光进行恢复培养7d；

(6)抗性苗的筛选

将恢复培养7d后的烟草叶片材料转入含Kan 50mg/L、头孢霉素400mg/L和D-丝氨酸12mM的分化培养基中；将愈伤组织材料转入含Kan 30mg/L、Cef400mg/L和D-丝氨酸6mM、Cef 400mg/L的分化培养基中；25℃遮光培养6d后，转入光照时间为16h/d，光照强度为2000-3000Lux条件下培养，每20d左右继代一次最终获得不定芽苗；

(7)生根选择培养

待不定芽长到3cm以上时，切下并分别插入生根培养基1/2MS+IBA 2mg/L+Kan 30mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L和1/2MS+IBA 2mg/L+D-丝氨酸6mM+蔗糖20g/L+琼脂6g/L上进行筛选培养。