[发明专利]一种新型筛选标记玉米丝氨酸消旋酶基因应用于烟草转化技术在审
申请号: | 201510121857.3 | 申请日: | 2015-03-19 |
公开(公告)号: | CN104711276A | 公开(公告)日: | 2015-06-17 |
发明(设计)人: | 范军;项艳;赵华琳;王蕾蕾;董庆;李媛 | 申请(专利权)人: | 安徽农业大学 |
主分类号: | C12N15/55 | 分类号: | C12N15/55;C12N15/84;C12N15/66;A01H5/00 |
代理公司: | 江苏银创律师事务所 32242 | 代理人: | 何震花 |
地址: | 230031 *** | 国省代码: | 安徽;34 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 新型 筛选 标记 玉米 丝氨酸 消旋酶 基因 应用于 烟草 转化 技术 | ||
技术领域
本发明涉及组织培养技术和植物基因工程领域,提供了一种玉米丝氨酸消旋酶基因作为筛选标记在烟草遗传转化中的应用。
背景技术
植物的遗传转化研究主要是通过将具有优良性状的外源目的基因导入到植物基因组中,用标记基因筛选出真正含有目的基因片段的转化体,并使其完整再生,通过这种方式获得遗传性状改良的转化植株。其中标记基因可以在遗传转化中筛选和鉴定出转化的植物细胞、植物组织和转基因植株,起到区分转化和非转化细胞的关键作用。依据筛选方法不同可分为选择标记(selective gene)和报告基因(reporter gene)。选择标记基因通常是指抗生素和除草剂抗性基因,而报告基因有葡萄糖苷酸酶基因(GUS)、荧光素酶基因(LUC)和绿色荧光蛋白基因(GFP)等。出于对生态环境以及转基因食品的生物安全性等方面的考虑,标记基因又可分为传统的选择标记基因(traditional selective marker gene)和生物安全性标记基因(biosafety marker gene)。
目前传统的选择标记基因分为抗生素类标记基因以及抗除草剂类标记基因。其作用原理是通过在选择压力下筛选出来转化体。前者可以使抗生素失去活性,从而解除抗生素对转化细胞在转录和翻译过程中的抑制作用,使转化细胞可以继续生长。其中卡那霉素抗性(Kanamycin,Kan)基因是转基因植物中被广泛使用的一类标记基因,但由于卡那霉素选择剂对一些植物的生长发育存在着严重的副作用,且选择效率低下。而抗除草剂类标记基因能通过抵抗除草剂的杀灭作用,使得转化子从野生背景中富集出来,例如草丁膦乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase,PAT)基因、2,4-D单氧化酶(2,4-D monooxygenase,tfdA)基因和5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase,EPSPS)基因等。但有些报道表示,释放转入抗除草剂类标记基因的植物,很有可能会导致环境中除草剂施用量达到选择浓度,从而发生一系列生物安全性问题,诸如基因漂流、生态平衡破坏和自然生物种群发生改变等。因此,这两类标记基因对于环境均存在着潜在的生物安全性问题。
丝氨酸消旋酶(Serine Racemase,SR)被发现存在于多种生物体中,是一种双功能酶,同时具有消旋酶和脱水酶两种活性。基于丝氨酸消旋酶的起源和功能,可以将丝氨酸消旋酶分为两类,第一类是细菌中的丝氨酸消旋酶,如鹑鸡肠球菌(Enterococcus Gallinarum,EG)和链霉菌属(Streptomyces Garyphalus,SG)。第二类是真核生物中的丝氨酸消旋酶,如水稻、人类、小鼠、裂殖酵母、细胞粘菌等。这些真核生物中的丝氨酸消旋酶属于Ⅱ型5'-磷酸吡哆醛酶(5'-pyridoxal phosphate enzyme,PLP)系,对PLP酶具有高度的特异性。
由于体外添加的D-丝氨酸对植物有毒害作用,植物体内能够去除D-丝氨酸毒性的酶如D-丝氨酸消旋酶,对植物具有解毒的功能,因此D-丝氨酸消旋酶可以作为植物核基因组转化的筛选标记。玉米丝氨酸消旋酶(maize serine racemase,SR)是一类依赖PLP型酶,同时具有消旋酶和脱水酶的两种活性。目前发现D-丝氨酸消旋酶能够介导植物开花。因此它更适合作为杨树的转基因筛选标记。可以将ZmSR作为一种新型的无抗性筛选标记基因,D-丝氨酸作为筛选试剂来筛选转基因植株,具有潜在的生产应用价值,为ZmSR作为筛选标记的可行性提供依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种玉米丝氨酸消旋酶基因及其表达载体,以及该基因作为筛选标记应用于烟草遗传转化。
本发明所涉及的设计方案为一种玉米丝氨酸消旋酶基因,ZmSR通过B73自交系三叶期cDNA为模板克隆获得,经过测序其为1014bp,与NCBI网站公布的玉米丝氨酸消旋酶基因(NM_001143028.1)序列一致。
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