[发明专利]一种神经生长因子制剂中神经生长因子含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种神经生长因子制剂中神经生长因子含量的测定方法，尤其涉及一种使用超高效液相色谱法中的凝胶色谱法测定神经生长因子制剂中神经生长因子含量的方法。

背景技术

神经生长因子(NGF)是神经系统最主要的活性成分之一，它能维持交感神经和感觉神经细胞的生存，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能，对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用，对保护神经系统的正常功能具有重要作用。

目前，国内生产、销售的各种NGF制剂均为冻干粉针剂型，并使用人血清白蛋白作为稳定剂，而一些携带来源于供血者血液中不易检测的病毒的人血清白蛋白会给生产的制剂带来污染，在患者用药的同时导致严重的传染性疾病，鉴于此种问题时有发生，已经开发出使用氨基酸的混合物作为稳定剂，替代人血清白蛋白，有效避免了人血清白蛋白导致的血液制品污染，并且降低了生产成本。

同时，含有使用人血清白蛋白作为稳定剂的NGF制剂，由于制剂中NGF的含量较低，而人血清白蛋白与NGF均为蛋白质，且在制剂中的浓度明显高于NGF，因而严重影响了NGF的准确定量。目前常用于生物制品中蛋白质含量测定的方法如Lowry法、紫外吸收法、Bradford法、酶联免疫吸附(ELISA)、SDS-PAGE法等均不能有效排除这种干扰，而且无法准确定量。公开号为CN1566941的专利中公开了一种测定制剂中神经生长因子含量的方法，该方法在检定时，虽然能够较准确地测定制剂中NGF的含量，但是该方法仍难以使NGF与白蛋白达到完全分离，也难以准确测定出有效成分NGF的含量，不利于产品质量控制。

有鉴于此，需要一种能够有效测定制剂中NGF含量的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以测定神经生长因子制剂中神经生长因子含量的方法。

除非特别指明，本发明中的“去白蛋白神经生长因子制剂”指“不含人血白蛋白的神经生长因子制剂，如含有稳定剂为氨基酸的神经生长因子制剂。

本发明的神经生长因子制剂中神经生长因子含量的测定方法为使用超高效液相色谱法中的凝胶色谱法测定神经生长因子含量，所述凝胶色谱法的色谱条件为：

凝胶色谱柱为分子量检测范围为1000～80000道尔顿、孔径为125-200埃的UPLC分子筛色谱柱；

流动相为pH值6.5～7.2，浓度为0.1～0.5M的磷酸盐缓冲液，所述流动相中有机相的含量为5～20体积％，所述有机相为乙腈、甲醇或异丙醇，优选为乙腈；所述流动相中有机相的含量优选为15体积％；

柱温为30～50℃；

所述流动相的流速为0.1～0.5ml/min，所述流速优选为0.1～0.3ml/min；

该检测器采用钛流通池，检测波长为205～280nm；优选地，所述检测波长为205～220nm；所述检测器优选为紫外检测器。

在本发明的较佳实施方案中，所述流速为0.2ml/min。

在本发明的较佳实施方案中，所述凝胶色谱柱选自Waters UPLC SEC，1.7μm，4.6×150mm，该色谱柱的分子量范围在1000～80000道尔顿、孔径为125埃。

在本发明的较佳实施方案中，流动相pH值为7.0，柱温为40℃。

在本发明的较佳实施方案中，检测波长为214nm。

在本发明的较佳实施方案中，凝胶色谱法的进样量为2μl。

在本发明的较佳实施方案中，所述制剂包括含人血白蛋白的神经生长因子制剂和去白蛋白神经生长因子制剂。

在本发明的较佳实施方案中，所述神经生长因子的含量通过外标法测定。

本发明相比较之前的测定方法，能够将NGF与辅料完全分开；并且检测时间缩短了4倍，溶剂使用量减小了3倍，样品量减小了10倍，适合于获得量较少的样品测定；同时，采用机器自动调整配比，进行pH值的调节，自动化程度高，减少了人为误差；最重要的是，有效排除了制剂中包含人血白蛋白在内的辅料的干扰，经过方法学验证，回收率均在95％～105％之间，回收率合格，而且重复性良好，可以对制剂中的NGF进行准确定量。

附图说明

图1表示流动相专属性图谱，

图2表示NGF对照专属性图谱，

图3表示含人血白蛋白NGF制剂空白辅料专属性图谱，

图4表示含人血白蛋白NGF制剂专属性图谱，

图5表示去白蛋白NGF制剂样品空白辅料专属性图谱，