[发明专利]一种美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ-3的分子量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤有效成分的分子量检测方法，特别涉及一种具有抗肿瘤作用的美洲大蠊活性部位提取物的质量控制方法。

背景技术

美洲大蠊(Periplaneta americana )属昆虫纲，蜚蠊目，蜚蠊科，大蠊属，俗称蟑螂。其入药史记载早见于《神农本草经》，其谓“味咸寒，治血痰症坚，寒热，破积聚，喉咽痹，内寒无子”。《本草纲目》中亦有记载，蜚蠊又名茶婆虫、香娘子，为本经中品，其主治“瘀血，症坚，寒热，下气，利血脉”，常用于治疗小儿疳积、疔疮、喉蛾，无名肿毒、膨胀、梅毒以及毒蛇、蜈蚣咬伤等疾病。

长期的科研探索发现，美洲大蠊具有广泛的药用价值和开发前景。大量研究证实了美洲大蠊具有抗肿瘤、抗病毒、促进组织修复、保肝、抗炎、镇痛等作用。目前，以美洲大蠊为原料药材开发研制的药物有“康复新液”、“心脉隆注射液”、“肝龙胶囊”等，因其疗效显著、副作用小等优点而广泛应用于临床。研究发现，“康复新液”不仅对体表创伤的修复作用显著，还可以治疗口腔溃疡、胃及十二指肠溃疡、溃疡性结肠炎等疾病。“心脉隆注射液”可改善微循环、兴奋呼吸、利尿、增强心肌收缩力、增大体内脏器血液循环。“肝龙胶囊”为昆虫类抗乙肝病毒(HBV)的国家二类中药新药。该药具有疏肝理脾、活血解毒的作用，在慢性乙型肝炎的治疗方面效果显著，具有安全、有效、副作用小、给药方便等特点。

本发明研究的具有抗肿瘤活性的美洲大蠊提取物CⅡ-3由大理学院科研团队经长期不懈的努力精心研制而成，其制备方法为：将新鲜或干燥的美洲大蠊虫体经醇水提取、大孔吸附树脂柱层析、醇溶剂洗脱等工艺制得 (中国专利：CN200810059054)。

大量文献报道了美洲大蠊提取物对肿瘤生长有显著的抑制作用。通过对美洲大蠊提取物CⅡ-3进行体外筛选，证明了该提取物对3株人肺癌细胞的生长均有一定的抑制作用[胡艳芬，吕小满，刘光明，美洲大蠊提取物对3株人肺癌细胞的体外抑制作用，大理学院学报，2009，8(12)：1]。何正春等人将美洲大蠊醇提物通过聚酰胺柱层析分离得到不同部位后，采用MTT法对所得部位进行肿瘤细胞毒性测试，发现高活性部位的IC₅₀值接近阳性药的三分之一，证明美洲大蠊醇提物中存在抑制肿瘤细胞生长的物质[何正春，王晓雨，杨雷香，美洲大蠊提取物对3株人体生殖系统肿瘤细胞的细胞毒性研究，西北药学杂志，2009，24(4)：271]。文献报道美洲大蠊提取物高剂量CⅡ-3可抑制H₂₂荷瘤小鼠肿瘤的生长，且能降低小鼠血清中血管生长因子(VEGF)的含量，机制可能为减少VEGF的表达，进而发挥抑制肿瘤生长的作用[陈俊雅，耿玲，张旭强，美洲大蠊提取物CⅡ-3对H₂₂肝癌小鼠血管生成作用的研究，肿瘤学杂志，2012，8(4)：274]。

在中药现代化发展迅猛的时代，药物的质量问题应倍受重视。关于美洲大蠊药材、提取物及其药物制剂的质量控制方法已有许多文献报道。本发明建立了美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ-3的分子量检测方法，为开发研制以美洲大蠊为原料药材的新型抗肿瘤药物的质量控制提供参考。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于研究美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ-3的分子量及其分布，设计该活性提取物的质量控制方法。

有关美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ-3的分子量检测方法尚未见文献报道，本发明通过研究，选用不同的分离柱进行分析，尝试了多种洗脱体系与色谱条件，最终建立了美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ-3的分子量检测方法。

本发明采用HPSEC法，该方法包括以下步骤：

(1)色谱条件与系统：以Superdex Peptide 10/300GL或TSK G2000PW_XL为色谱柱；以水(含0.1%TFA) -乙腈(0-50:100-50V/V)、磷酸盐缓冲液(pH=5~8)、Tris-HCl缓冲液(pH=7~9)中的一种为流动相，流速0.5~0.7ml/min；检测波长为200nm~400nm；进样量为5-50μl；柱温为20℃~30℃。

(2)标准物质溶液的配制：称取细胞色素C、VB₁₂、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、肌苷及酪氨酸适量，加水制成每1ml中各含0.1mg~2mg的溶液，分别过0.22μm滤膜，作为标准物质溶液。