[发明专利]基于内吗啡肽2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂交肽及其合成方法和应用

权利要求书

1.基于内源阿片肽内吗啡肽2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂交肽，其化学结构式为下式之一：

。

2.根据权利要求1所述基于内源阿片肽内吗啡肽-2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂交肽的合成方法，包括以下工艺步骤：

. EKR、RKE的合成

.树脂预处理：Rink-Amide-MBHA树脂在二氯甲烷中搅拌，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂；

.脱除Fmoc基团保护：在溶胀、抽干溶剂的树脂中，加入六氢吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、DMF的混合溶液，搅拌反应5 min后抽干，重复3次；最后加入DMF洗涤，茚检，得到脱除Fmoc基团保护的树脂；

. 连接子Lys的缩合：依次将N-(9-芴甲氧羰酰基)-N'-甲基三苯甲基-L-赖氨酸Fmoc-Lys(Mtt)-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐完全溶解于DMF中，再加入二异丙基乙胺后混匀得混合溶液；然后加至步骤.所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60 min，抽干溶剂；用DMF重复洗涤、抽干，茚检后按步骤.的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂；

.主链延长

ERK的主链延长：将步骤.所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤.、步骤.的工艺依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH和Boc-Tyr(tBu)-OH的缩合和脱Fmoc基团保护，并保留Boc-Tyr(tBu)-OH的Boc保护基团，得到肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys(Mtt)-Resin；

RKE的主链延长：将步骤.所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤.、步骤.的工艺依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、1-金刚烷酸的缩合和脱Fmoc基团保护，得到肽树脂1-金刚烷酰基化-Phe-Arg(Pbf)-Lys(Mtt)-Resin；

.Lys侧链Mtt保护基团的脱除：将步骤.得到的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe- Phe-Lys(Mtt)-Resin或1-金刚烷酰基化-Phe-Arg(Pbf)-Lys(Mtt)-Resin抽干溶剂后，加入体积浓度1%~1.5%的TFA/DCM溶液，搅拌90~120s后抽干，重复50次；最后加入DMF冲洗，得到脱除Lys侧链Mtt基团保护的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys-Resin或1-金刚烷酰基化-Phe-Arg(Pbf)-Lys-Resin；

.侧链延长

EKR侧链延长：将步骤.所得肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys-Resin按步骤.、步骤.的工艺依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、1-金刚烷酸的缩合和脱Fmoc基团保护，得到的肽树脂为Lys侧链连有1-金刚烷酰基化-Phe-Arg(Pbf)-结构的Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys-Resin；

RKE侧链延长：将步骤.所得肽树脂1-金刚烷酰基化-Phe-Arg(Pbf)-Lys-Resin按步骤.、步骤.的工艺依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH和Boc-Tyr(tBu)-OH的缩合和脱Fmoc基团保护，得到的肽树脂为Lys侧链连有Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-结构的1-金刚烷酰基化-Phe-Arg(Pbf)-Lys-Resin；

. EKR和RKE的肽链从树脂上的切割：将步骤.所得肽树脂用DCM、MeOH交替洗，充分抽干溶剂后，加入切割剂，于室温下切割反应2~3小时；过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的乙醚析出沉淀；吸出上清液弃之，加水充分溶解沉淀后将乙醚从水相中分离除去，水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末；

. EKR和RKE的脱盐和纯化：以体积浓度15~20%乙酸溶液为流动相，过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱；利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得脱盐的肽化合物；再用反相高效液相色谱柱对脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰。