[发明专利]一种捕获内皮祖细胞EPCs的新型抗凝血支架涂层的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学工程材料，尤其是获得具有良好血液相容性的捕获干细胞及内皮祖细胞EPCs的多功能涂层。

背景技术

据世卫组织报到，心血管疾病已成为人们死亡的主要杀手，PCI支架介入手术治疗是较为成熟有效的方法，能够极大的减轻人们的痛苦和降低死亡率。然而，在介入手术治疗后，再狭窄和晚期血栓在支架介入后3-6个月仍然有高达30％的比率发生，这主要由于支架表面生物相容性和功能性的不足，不能够快速的形成完整连续的内皮层所致。血管内层主要由单层的内皮细胞和基膜构成，中层主要有平滑肌细胞构成，新生内膜的形成主要通过内皮细胞的迁移、增殖，以及EPCs内皮祖细胞的动员、归巢和分化共同作用，内膜增生的主要原因是由于SMCs平滑肌细胞的快速增生所导致的，因此如何快速内皮化成为发展新的血管介入器械的研究热点和主要策略。EPCs是内皮细胞ECs的前体细胞，能够通过一定的信号路径和信号因子分化成内皮细胞，在人体组织受到损伤时，来自于骨髓中的外周血EPCs细胞被大量动员起来参与缺血组织的修复。晚期血栓的发生主要取决于材料和血液接触的界面的相互排斥所产生的，因此可以通过构建具有多功能的生物分子涂层在能够促进血管表面的快速内皮化的同时提高材料的生物相容性，避免内膜增生和晚期血栓发生，这是一种十分完美的设想。当前流行的策略是构建能够仿生细胞外基质膜的组成和构建促进内皮细胞生长的友好微环境，亦或诱导归巢内皮细胞生长的生物工程涂层等，例如构建肝素heparin,REDV多肽,VEGF生长因子的混合涂层，当然，最具有创新性的策略是通过捕获外周血中EPCs，从而最大化的促进血管的快速内皮化。应用CD34+抗体涂层的血管支架的显著降低了再狭窄和晚期血栓的发生，但是CD34+不是EPCs的特异性标记物，还能够分化成其它的细胞，从而导致再狭窄的产生，因此循环血液中的其它细胞也能管被CD34+抗体捕获，如红细胞和成纤维细胞被捕获等。CD133+作为造血干细胞和EPCs的特异性标记物，属于CD34+抗体家族一员，CD133+抗体能够有效捕获外周血中的EPCs祖细胞和造血干细胞，研究表明CD133+细胞能够有效提高损伤组织功能的恢复，同时动员EPCs细胞参与血管修复。然而，在大多数情况下，往往促进内皮化的同时，植入材料表面的抗凝血性能和血液相容性较差，例如胞外基质蛋白，CD133等，因此我们还需要共接枝一种具有优秀生物相容性的生物分子。低分子量岩藻聚糖Fucoidan(来自于fucus vesiculosus)是一种褐藻中提取的水溶性的硫酸盐多糖，相关研究表明低分子量岩藻聚糖LMWF(分子量小于10000)具有抑制平滑肌的生长从而达到控制内膜增生的目的，同时由于较高的硫酸盐含量，有着优良的抗凝血作用，能够通过束缚纤维胶原抑制抗凝血达到提高生物相容性的目的。尤为重要的是岩藻聚糖Fucoidan还可以促进内皮祖细胞EPCs增殖和动员EPCs迁移参与血管修复成管的能力，因此低分子量岩藻聚糖LMWF作为一种理想的生物分子共同构建捕获和趋化EPCs的良好的生物相容性的多功能涂层。多巴胺做为一种理想的生物仿生涂层基底，它具有极好的粘附性能在各种材料表面吸附，并且潜在做为反应平台固定各种蛋白，以及其优良的血液相容性。EDC/NHS/MES做为反应共价偶联剂，能够催化加速共价固定生物的涂层固定，相较其他物理化学的方法，相对稳定可靠和可重复性，随后我们通过QCM-D筛选出最优的pH和EDC/NHS/MES浓度作为构建CD133和Fucoidan的多功能复合涂层的反应条件。

发明内容

鉴于现有技术的以上缺点，本发明的目的是获得一种用于捕获内皮祖细胞的血管支架的抗凝血材料表面涂层的制备技术。目标物涂层的制备具有更好的材料涂层的生物相容性和血液相容性。并使其具有具备操作简单，成本相对低廉的优点。

本发明为解决其技术问题，所采用的步骤如下：

一种捕获内皮祖细胞EPCs的新型抗凝血支架涂层的制备方法，由如下步骤获得：

a)将需要的基底支架依次用SDS，乙醇，去离子水超声清洗三次，每次10min，然后干燥处理；

b)基底支架羟基化处理：将a)处理完成的基底支架放入浓硫酸与双氧水按照体积比7:3配比配制的溶液中在100℃浸泡2h；然后用去离子水清洗3次，每次5min；

c)将b)步所得羟基化基底支架放到Tris-base(10mM,pH8.5)缓冲溶液中,浸泡8h,然后用离子水超声清洗3次，每次5min，然后继续浸泡，连续3次，获得表面沉积多巴胺薄膜的基底支架，密封保存；