[发明专利]一种同时检测CSFV、PRRSV、PRV、PCV2的四色荧光定量PCR方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种同时检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型的四色荧光定量PCR联合检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus, CSFV）引起的一种高度接触性热性传染病，该病传染性高，致病性强，猪是本病唯一的自然宿主。感染的病猪主要表现为特征性病理变化，内脏出血，梗塞和坏死，死亡率很高，给养猪业带来了重大的经济损失。病猪是本病最主要的传染源，易感猪与病猪的直接接触是病毒传播的主要方式。在我国，猪瘟流行呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存、持续感染和隐形感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等形式；在国外，比利时、德国、荷兰爆发的猪瘟也表明，猪瘟的流行形式在发生改变，这给全世界的养猪业带来了新的挑战。CSFV与牛病毒性腹泻病毒（Bivine viral disease virus，BVDV）和羊边界病毒（border disease virus，BDV）同属黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（pestivirus），在进行抗原检测的时候，能发生交叉免疫反应，而针对基因设计特异的引物、探针，则可以有效地避免交叉检出。猪瘟病毒基因组为单股正链RNA，长约12.3KB，含一个大的开放阅读框（ORF），病毒粒子呈球形，直径40-50nm，二十面体对称，其芯髓直径29-30nm，有囊膜。

猪蓝耳病即猪繁殖与呼吸综合征，是由猪蓝耳病病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）引起的一种高度接触性传染病，在大多数国家中呈流行性感染。猪发病后临床表现差异极大，是该病的显著特征之一。临床症状主要是繁殖障碍，包括怀孕后期流产、早产和死胎，育成猪的呼吸道症状。发病母猪体温升高，厌食，部分患猪的背侧、双耳的耳尖及边缘呈红蓝色。发病公猪性欲减退，生产性能下降。发病仔猪出生时死亡或产出后个体小。患猪死亡后的主要病理变化是：眼球肿胀突出，头、臀部皮下水肿，胸腔、心包积水，心室扩张，心肌变化萎缩，肾脏皮质部点状出血，肺脏呈间质性肺炎病变。1991年病原首次鉴定，病毒是单链RNA病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，但是病毒的来源并未确定。1985年美国猪群猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体的存在说明该病毒在发病之前就已经存在。我国的PRRSV分离毒株大多属于基因2型，即北美型。而高致病性猪蓝耳病病毒，是指非结构蛋白2（Nsp2）编码区连续缺失12个氨基酸的毒株，并对猪呈现致死性。

伪狂犬病(Pseudorabies，PR又名Aujeszky's disease，AD)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的一种传染病。该病最早发现于美国，后来由匈牙利科学家首先分离出病毒。伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又称猪疱疹病毒Ⅰ型、传染性延髓麻痹病毒、奇痒症病毒、奥叶兹基氏病病毒。是引起牛、羊、猪、犬和猫等多种家畜和野生动物发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为主要症状的疱疹病毒。由于本病的临床症状类似狂犬病，故用了“伪狂犬病”这一病名。本病毒是疱疹病毒中抵抗力较强的一种，在不同的液体中和物体表面至少存活7d。本病毒对乙醚、氯仿等脂溶剂、福尔马林和紫外线照射等敏感；在pH 4～9之间稳定；对热抵抗力较强。真空冷冻干燥的病毒培养物可保存多年。蛋白质序列表明，PRV与牛疱疹病毒（BHV-1）、马疱疹病毒（EHV-1）以及水痘病毒的同源性很高。目前, 在国内用于预防猪伪狂犬病的疫苗主要是基因缺失的弱毒( Bartha-K 61)，在其基因组BamH I-7片段中缺失了约4kb的序列, 此序列包括整个gE ( g 1)和大部分g I( gp63)序列。而本专利以gC基因作为靶序列，设计出用于检测出伪狂犬病毒野毒株以及疫苗株的引物和探针。