[发明专利]卵形鲳鲹家系亲子鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类育种和分子标记技术领域，具体涉及一种利用微卫星分子标记鉴定卵形鲳鲹混养家系子代亲本的方法。

背景技术

卵形鲳鲹隶属鲈形目(Perciformes)，鲹科(Carangidae)，鲳鲹亚科(Trachinotinae)，鲳鲹属(Trachinotus)，俗称金鲳，黄腊鲳等，是一种中上层暖水性鱼类，广泛分布于热带、亚热带海域，具有生长速度快，肉嫩味美，营养价值高等特点，现已成为我国南方沿海池塘和网箱养殖的重要经济品种。

近些年来，卵形鲳鲹市场需求量大幅上升，已经成为南方海水养殖鱼类的最大宗种类，目前我国金鲳商品鱼年产量20万吨以上，仅广东湛江鱼类交易市场每天就有500吨冰鲜卵形鲳鲹交易量。这样大的市场对卵形鲳鲹苗种的需求量也是非常巨大的。卵形鲳鲹是暖水性海水鱼类，卵形鲳鲹受温度条件影响养殖区域主要集中在海南、广东、福建等地。而海南地处亚热带、热带地区，海水温度相对较高，适宜卵形鲳鲹的孵化与育苗。目前，三省区所有卵形鲳鲹养殖苗种均来自于海南地区。由于卵形鲳鲹普遍存在近亲繁殖的现象,导致苗种种质退化,生长缓慢,病害爆发等问题日益凸显。传统苗种繁殖产业所采用的野种家养模式面临着巨大的挑战，对于卵形鲳鲹进行良种选育便成为水产养殖研究者迫在眉睫的任务。

家系选育是鱼类育种的重要基础手段，是根据某个或某几个性状明显优于其亲属、生产性能显著高于其亲属的混有不同类型的原始群里选出一些优良个体留种，建立几个或若干个家系并繁殖后代，逐代与原始群体及对照品种相比较，选留那些符合原定选择指标的优良系统，进而进行品系性能测定。在鱼类育种中,家系选育尤为重要，几乎所有育成种类均需要经过家系选育这一步骤。目前鱼类人工家系的建立通常采用1(雌)对1(雄)交配生产子代。这样的方式建立的家系数量较少，而且单独管理每个家系受环境影响较大，对家系选择不利；而对混合家系进行个体的物理标记，在较多家系的情况下非常困难。目前对于卵形鲳鲹繁殖成熟度及雌雄性别的判断比较困难，也并不适用1对1的生产方式。因此对于卵形鲳鲹家系的建立和家系的鉴定一直是难以解决的问题,在很大程度上阻碍的卵形鲳鲹育种工作。

微卫星DNA(Microsatellites DNA)是广泛分布于真核生物基因组中的一种中度重复序列。微卫星标记以其多态性丰富，共显性遗传的优点被广泛应用于群体遗传结构分析，性状分析，种质鉴定，家系鉴定,遗传作图等领域。亲本的微卫星遗传信息可以通过繁殖传递给子代，微卫星标记技术通过检测不同亲子个体的微卫星差异区分个体所属家系。目前尚未见将微卫星标记用于卵形鲳鲹家系鉴定的报道。

发明内容

本发明的目的是提供了一种利用微卫星标记鉴定卵形鲳鲹家系的方法，为卵形鲳鲹育种提供亲子鉴定的分子标记工具。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种卵形鲳鲹家系亲子鉴定的方法，该方法包括如下步骤：

1)选择卵形鲳鲹体型较大，生长速度较快的个体87尾作为亲本，将亲本混合进行人工繁殖；待鱼苗长到10公分时随机选取1万尾转入网箱养殖，作为用于亲子鉴定的家系群体；

2)选取步骤1)的卵形鲳鲹繁殖亲本的鳍条组织，提取基因组DNA，以DNA为模板，选用51对微卫星引物进行巢式PCR扩增；

3)步骤2)所述的巢式PCR扩增方法指PCR体系内包含3个引物：位点特异性正向引物，其5’末端加M13序列(5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)；位点特异性反向引物；FAM、PET、VIC、NED四种荧光标记的M13通用引物；PCR反应体系20ul：50ng DNA，2ul dNTP(2.5mM)，2ul10×Buffer mixture，1U rTaq，0.4ul的含加通用引物M13的正向引物(10mM)，0.5ul反向引物，0.1ul的荧光标记通用引物，ddH₂O补足；

4)卵形鲳鲹亲本在51个微卫星位点的PCR产物经ABI3730型基因分析仪，根据荧光标记进行基因型分析，使用Genemapper3.7软件模拟分析，筛选出适合鉴定卵形鲳鲹混养家系的有效微卫星位点11个：ZD13、ZD15、TBG008、ZD02、ZD03、ZD04、ZD11、ZD12、ZD01、ZD10、TBG016；

5)将卵形鲳鲹1万条子代混养7月龄，随机选取2000尾个体，在每条鱼的背部肌肉植入电子标记并剪取每个个体鳍条组织，提取个体基因组DNA，选取步骤4)中的11个有效微卫星位点，分析子代的基因型；