[发明专利]重组抗虫蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.重组抗虫蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，编码该蛋白的抗虫基因NGc的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。

2.植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc，其特征在于，该载体中含有抗虫基因NGc，该载体的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:3所示。

3.根据权利要求2所述的植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc，其特征在于，通过对载体pTF101进行改造来构建植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc：在载体pTF101原有架构的基础上，选择除草剂抗性基因bar为筛选标记基因，由启动子2XP35S驱动，由终止子Tvsp终止筛选标记基因bar转录；由启动子ubi启动抗虫基因NGc表达，由终止子nos终止抗虫基因NGc转录，通过启动子ubi驱动将抗虫基因NGc分别连接入载体pTF101的Sma I位点和Sac I位点，构建植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc。

4.根据权利要求2所述的植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc，其特征在于，该载体包括：

启动子ubi，为玉米基因组基因ubi，长2022bp，负责启动抗虫基因NGc表达；

终止子nos，为根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区胭脂碱合成酶基因，长268bp，负责终止抗虫基因NGc转录；

筛选标记基因bar，为除草剂抗性基因bar，来源于吸水链霉素，编码区552bp，编码184个氨基酸；

启动子2XP35S，来自花椰菜花叶病毒CaMV，长663bp，负责启动筛选标记基因bar表达；

终止子Tvsp，长650bp，负责终止筛选标记基因bar转录。

5.制备权利要求1所述的重组抗虫蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、Cry蛋白家族改造区域的确定

从NCBI数据库中查找Cry蛋白家族中Cry1A105蛋白、Cry1Aa1蛋白、Cry1Ab1蛋白、Cry1Ab5蛋白、Cry1Ab14蛋白、Cry1Ac1蛋白、Cry1Ah1蛋白、Cry1Ba1蛋白、Cry1Bb1蛋白、Cry1Be1蛋白、Cry1Bf1蛋白、Cry1Fa1蛋白、Cry1Gc蛋白、Cry1Ia1蛋白、Cry1If1蛋白、Cry1Ja1蛋白、Cry1Jb1蛋白、Cry1Jc1蛋白、Cry2Ab1蛋白、Cry2Ac1蛋白、Cry2Ae1蛋白、Cry9Aa1蛋白、Cry9Ca1蛋白、Cry9Ec1蛋白的氨基酸序列；利用pMAL算法和perl编程语言，采用进化率分析方法，确定在分子进化过程中Cry蛋白氨基酸序列的高进化活性区域；

将分析得到的高进化活性区域分为区域A～F，区域A为氨基酸位点在36～120之间，区域B为氨基酸位点在121～254之间，区域C为氨基酸位点在255～360之间，区域D为氨基酸位点在361～461之间，区域E为氨基酸位点在462～539之间，区域F为氨基酸位点在540～606之间，Cry蛋白的氨基酸序列中共有150个位点的氨基酸残基具有进化活性，即位点Ka/Ks>1，Ka为氨基酸突变率，Ks为同义突变率，其中进化活性较高的位点有45个，即位点Ka/Ks>1.45，这45个位点的氨基酸残基分布为：区域A有1个高进化活性的氨基酸残基，区域B有2个高进化活性的氨基酸残基，区域C有12个高进化活性的氨基酸残基，区域D有3个高进化活性的氨基酸残基，区域E有16个高进化活性的氨基酸残基，区域F有11个高进化活性的氨基酸残基，因此，区域A和区域B均为保守区域，区域C、区域D、区域E和区域F为高进化活性区域；

步骤二、构建抗虫基因库

(1)选取NCBI数据库中具有抗鳞翅目虫活性的基因建立数据集，通过BLAST进行局部相似性比对；

根据四级核苷酸同源性差异选择Cry基因：

Cry1Ab1基因、Cry1Ab5基因、Cry1Ab14基因：核苷酸同源性大于95％；

Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ah基因：核苷酸同源性在78％～95％之间；

Cry1A基因、Cry1B基因、Cry1F基因、Cry1G基因、Cry1I基因、Cry1J基因：核苷酸同源性在45％～78％之间；

Cry1基因、Cry2基因、Cry9基因：核苷酸同源性低于45％；

(2)采用最大简约法建立系统进化树：首先采用Clustalx2.0软件对所选的Cry基因进行多重比对，再利用MEGA 5软件建立取代模型，同时建立Cry蛋白氨基酸序列系统进化树并评估系统进化树；

(3)根据系统进化树上显示的氨基酸序列进化亲缘关系，选择核苷酸同源性在78％～95％之间的基因，即选取Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因作为代表，从NCBI数据库中查找Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因的编码序列；

(4)区域A和区域B均为保守区域，将区域A和区域B合成为一个区域A+B，选取Cry1Ab基因作为区域A+B的供体，合成Cry1Ab基因N端区域A+B的编码序列，获得长度为1～1410bp的基因片段，编码N端1～470个氨基酸；

区域C、区域D、区域E和区域F均为高进化活性区域，将区域C和区域D合成为一个区域C+D，将区域E和区域F合成为一个区域E+F，选取Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因分别作为区域C+D、区域E+F的供体，分别合成Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因区域C+D、区域E+F的编码序列，共获得16个基因片段；

(5)将上述合成的多个基因片段分别进行连接，构建64个基因，如下表所示：

步骤三、构建重组Cry蛋白

将质粒pET28和64个基因采用Nco I内切酶和BamH I内切酶分别进行双酶消化；将经双酶消化的64个基因分别连接质粒pET28，构建64个载体；通过菌落PCR、双酶水解和测序对64个载体进行逐级验证；将验证正确的载体转入表达宿主E.coli BL21(DE3)plysS中进行诱导表达，获得64个重组Cry蛋白；

步骤四、重组Cry蛋白突变体抗虫活力测试

将亚洲玉米螟卵泡于培养皿中，加入不含毒蛋白的人工饲料，待亚洲玉米螟卵孵化成幼虫后分成三组进行测试，即实验组，阴性对照组和空白对照组，每组接亚洲玉米螟幼虫50头，即每组有10个培养皿，每个培养皿中接亚洲玉米螟幼虫5头，同时，将实验组饲料换成含纯化重组Cry蛋白溶液的人工饲料，将阴性对照组饲料换成含有空表达载体pET28的纯化表达宿主菌全蛋白溶液的人工饲料，将空白对照组饲料换成蒸馏水，纯化重组Cry蛋白溶液浓度和纯化表达宿主菌全蛋白溶液浓度为同一数量级，且纯化重组Cry蛋白溶液与纯化表达宿主菌全蛋白溶液的加入量相同，实验组饲料总用量与阴性对照组饲料总用量也相同，72小时后观测抗虫效果，测定64个重组Cry蛋白的抗虫活性；

结果显示：重组Cry1Ab-1Ab-1Gc蛋白对亚洲玉米螟幼虫的毒性高，幼虫死亡率高，抗虫效果优于阴性对照组、空白对照组和其他试验组；

步骤五、合成抗虫基因NGc

根据步骤四的测试结果，按照单子叶植物编码特征，利用基因编码框、消除稀有密码子、二级结构最小化、调整GC含量方法对编码重组Cry1Ab-1Ab-1Gc蛋白的Cry1Ab-1Ab-1Gc基因进行密码子改造，合成抗虫基因NGc，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示，改造后的抗虫基因NGc与Cry基因的核苷酸序列最大同源性为77％；

对合成的抗虫基因NGc进行表达后得到重组抗虫蛋白NGc，其氨基酸序列如序列表中的序列1所示。

6.根据权利要求5所述的重组抗虫蛋白的制备方法，其特征在于，步骤四中，纯化重组Cry蛋白溶液浓度和纯化表达宿主菌全蛋白溶液浓度均为100μg/mL。