[发明专利]重组抗虫蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及抗虫蛋白及生物安全技术领域，具体涉及一种重组抗虫蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)，Bt基因即是苏云金芽胞杆菌基因，其编码的Bt毒蛋白能被苏云金芽胞杆菌分泌到菌体外，20世纪50年代中期，科学家发现Bt毒蛋白对鳞翅目、鞘翅目等昆虫的毒性来自于孢子形成过程中产生的晶体蛋白质，1981年，科学家提纯了这种蛋白质并命名为Cry，随后他们克隆出了Cry的基因。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry(以下简称为Cry蛋白)是根据氨基酸同源性的不同进行分类的：同源性在45％以下，为第一等级，用阿拉伯数字表示；同源性在45％～78％之间，为第二等级，用大写英文字母表示；同源性在78％～95％之间，为第三等级，用小写英文字母表示；同源性在95％以上，为第四等级，用阿拉伯数字表示，例如Cry1Ac10蛋白。

不同Cry蛋白特异性毒杀昆虫的种类不同，这主要取决于Cry蛋白与昆虫中肠道上皮细胞膜上的受体相互作用的结果(KnowlesB.等，1993)。相关的研究表明，Cry蛋白的毒性与毒性肽和膜受体的结合力呈正相关(HofmannC.等，1989)，一般是Cry蛋白以原毒素的形式存在，在碱性条件下溶解，在蛋白酶作用下水解掉C端非活性部位而变成活性毒性肽，此活化的毒性肽与昆虫中肠道膜上的受体结合，毒性区结构域I的α螺旋使膜穿孔，从而破坏膜细胞的渗透平衡；结构域II具有与中肠道上皮细胞膜结合的能力，与受体结合以及决定靶标昆虫特异性；结构域III为稳定与毒素受体的结合、决定特异性以及门控离子通道，可应用于人为的Cry蛋白分子改造，改造可能会影响到对毒素受体的识别，改变亲代毒蛋白的抗虫谱及抗虫活力。

1991年，Perlak等人通过两种方法对Cry1Ab蛋白进行改造，其一是在不改变Cry1Ab蛋白氨基酸顺序的基础上，通过点突变方法对Cry1Ab蛋白进行部分改造，即改变3％碱基序列，其二是在保持Cry1Ab蛋白活性中心与结构的前提下，按照高等植物所偏爱密码子的原则，通过人工合成方法对Cry1Ab蛋白进行完全改造，即改变21％碱基序列。1995年，Ballcster等人发现对甜菜夜蛾没有毒性的Cry1E蛋白和Cry1Ab蛋白，两者的结构域III分别被具有毒性的Cry1C蛋白的结构域III取代后都具有了毒性；对烟芽夜蛾低毒的Cry1Aa蛋白的结构域III被毒性更高的Cry1Ac蛋白的结构域III置换后，能够增加Cry1Aa蛋白的毒性。2006年，郭青云等人通过体外重组的方法实现了Cry1Aa蛋白和Cry1Ca蛋白的功能性结构域I、II、III互换，得到了6株苏云金芽孢杆菌重组菌株，经过对各杂交杀虫晶体蛋白独立测定，发现比野生型杀虫晶体蛋白毒力减弱，从而证明了杀虫晶体蛋白不同结构域的相互作用会影响杂交杀虫晶体蛋白的表达、晶体形态和杀虫活性。

Cry蛋白家族中，Cry1Ab蛋白、Cry1Ac蛋白和Cry9C蛋白对亚洲玉米螟的杀虫活性最强，商品化转基因抗虫玉米中主要应用编码上述三种蛋白的Cry1Ab基因、Cry1Ac基因和Cry9C基因。目前，Cry基因的获得主要是从天然苏云芽孢杆菌或自然宏基因组文库中克隆，并进一步利用大肠杆菌表达、抗虫性鉴定等研究策略高通量筛选抗虫基因。物种之间通过不断的加速进化竞争性生存，以病毒蛋白进化为例，进化率越快的病毒蛋白具有越高的与宿主蛋白结合的能力，即：侵染能力越强。但由于自然界菌株变异速率相对较慢，获得更高抗虫性的Cry蛋白越来越困难，因此，获得进化率快的Cry基因对于高抗虫材料的获得至关重要。

通过转基因技术，可以将抗虫基因导入玉米品种中，进而提高转基因玉米的抗虫性，降低农药的使用量，节省人力、物力及社会资源。因此，应用新的高抗昆虫蛋白、提高杀虫蛋白的表达量以及培育转基因抗虫玉米是解决上述问题的最有效途径之一。美国的科学家把Cry基因转入玉米和棉花中，转基因玉米和棉花在美国成功地上市，至今未发现它们对人类有任何负面影响，这种转基因作物对于环境的贡献是巨大的。在中国，也有许多科学家在致力于转Bt基因玉米的研究。中国农业大学的王国英教授研究的转Bt基因玉米已经在国内进行了环境释放。转Bt基因玉米在中国的商业推广将给玉米生产和种植者带来极大的收益。中国自2008年国家启动《转基因生物新品种培育科技重大专项》后，在转基因抗虫玉米品种培育方面虽有些报道，但却没有能够最终商业化，这主要归结于Bt基因的抗虫效果及转化植株的稳定性。

发明内容