[发明专利]一种基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体及重组细胞

权利要求书

1.基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体，其特征在于，所述载体为TALEN真核表达载体和BLG基因敲除载体；所述TALEN真核表达载体为上游位点识别表达载体和下游位点识别表达载体；

所述的BLG基因敲除载体为含有5’同源臂和3’同源臂的打靶载体，其中5’同源臂的末端和3’同源臂的首端落在TALEN识别位点之间，并且两者之间相隔一定长度的BLG阅读框；

所述的TALEN真核表达载体所针对的TALEN识别位点位于BLG基因第一外显子；

所述的TALEN真核表达载体所表达的蛋白识别BLG基因第一外显子上的TALEN识别位点，切割并产生双链断裂，启动DNA双链断裂修复；

所述的BLG基因敲除载体的5’同源臂、3’同源臂分别与BLG基因的同源序列发生同源重组，5’同源臂、3’同源臂同时发生同源重组是5’同源臂与3’同源臂之间间隔的BLG阅读框被敲除；

所述的TALEN识别位点是位于BLG基因第一外显子靠近信号肽序列的序列；

所述的5’同源臂是与BLG基因第一外显子上游1000～1500bp的序列相同源；所述的3’同源臂是与BLG基因第一外显子下游1000～1500bp的序列相同源；两者之间间隔10～30bp的BLG阅读框；

所述的TALEN识别位点是位于BLG基因第一外显子的+47～+94位序列，其中上游识别位点为+47～+62位，下游识别序列为+78～+94位；

所述的5’同源臂是与BLG基因第一外显子的-1028～+60位的序列相同源；所述的3’同源臂是与BLG基因第一外显子的+80～+1422位的序列相同源；

所述的上游位点识别表达载体是载体pCS2-BLG-L，通过将上游识别位点序列TALEN-BLG-L克隆到载体pCS2-FokI-PEAS得到；所述的下游位点识别表达载体是载体pCS2-BLG-R，通过将下游识别位点序列TALEN-BLG-R克隆到载体pCS2-FokI-PERR得到；

所述的BLG基因敲除载体是将5’同源臂、3’同源臂分别克隆于包含loxP位点的载体ploxPⅡ中，其中5’同源臂位于loxP位点的上游，3’同源臂位于loxP位点的下游；

所述的TALEN-BLG-L序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述的TALEN-BLG-R序列如SEQ.ID.NO.2所示；

所述的BLG基因敲除载体为载体pBLG-Neo，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

2.权利要求1所述的基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体在构建BLG基因敲除的细胞中的应用，所述细胞为山羊胎儿成纤维细胞。

3.一种权利要求1所述基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体构建的重组细胞，其特征在于，以山羊胎儿成纤维细胞为宿主细胞，将TALEN真核表达载体和BLG基因敲除载体共转染到宿主细胞中，筛选得到了5’同源臂、3’同源臂同时发生了重组的细胞。

4.一种权利要求1所述基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体构建的重组细胞，其特征在于，以山羊胎儿成纤维细胞为宿主细胞，将线性化的TALEN真核表达载体进行体外转录生产mRNAs，得到T-mRNAs；将T-mRNAs和BLG基因敲除载体共转染到宿主细胞中，筛选得到了5’同源臂、3’同源臂同时发生了重组的细胞。

5.权利要求3或4所述的重组细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。