[发明专利]一种基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体及重组细胞

说明书

本发明公开了一种基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体及重组细胞。本发明根据山羊β‑乳球蛋白基因，设计并构建了针对其第一外显子的TALEN真核表达载体以及含有较短同源臂的BLG基因敲除载体，与以TALEN表达载体为模板体外转录的mRNAs共同转染山羊胎儿成纤维细胞，经药物筛选及鉴定后得到β‑乳球蛋白基因敲除细胞。本发明利用TALEN技术大大提高了基因打靶效率，同时较短同源臂的利用可以更方便高效的进行中靶细胞的筛选，mRNAs的利用则避免了TALEN表达载体在基因组中的随机整合。

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，涉及一种基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体及重组细胞。

背景技术

β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)是反刍动物乳汁中的主要乳清蛋白，约56％-60％，在人和啮齿动物乳汁中基本不存在(Kontopidis G et al.2004)，是引起婴幼儿乳过敏症的主要致敏原之一。目前降低BLG致敏性的生物化学方法有多种，如热处理、酶解、糖基以及发酵等。这些方法虽然对降低BLG过敏症有一定的效果，但却不能从根本上解决BLG的致敏性问题。随着分子生物学技术的发展，RNA干扰技术可有效的降低牛乳中的BLG，其扰效率可达到100％。然而，利用RANi生产转基因动物缺乏遗传稳定性，且干扰载体在动物基因组中的随机整合会产生意想不到的表型。

基因打靶技术是利用同源重组对生物体基因组进行定向修饰以改变其遗传信息的技术，广泛的应用于小鼠胚胎干细胞以生产基因敲除或外源基因定点插入个体。但由于至今家畜中尚未分离到具有生殖系嵌合能力的ES细胞，因此在体细胞中进行基因打靶然后借助体细胞核移植技术是目前生产基因打靶家畜的唯一方法。然而，由于体细胞中同源重组的效率低于10^-6，导致了较低的基因打靶效率。此外，转录沉默的基因的打靶效率较转录活跃的基因低10倍左右，因为前者的同源重组效率更低。

人工核酸内切酶(Engineered endonuclease,EEN)，是通过基因工程的方法，将特定的DNA结合蛋白跟特定的核酸内切酶相互融合构建而成的一种人造蛋白，如锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-like effectornuclease,TALEN)。EEN主要包含两个结构域，一个可特异性识别并结合DNA靶序列的结合结构域，；另一个是用来切割DNA靶序列,造成DNA双链断裂(Double-strand break,DSB)的DNA切割结构域。DSB能够激活细胞内固有的非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)或同源重组(Homologous recombination,HR)机制，对这种DNA损伤进行修复。其中NHEJ是一种较为简单的修复方式,但是保真度不高，很容易造成DNA断裂处的序列发生改变,产生未知的DNA小片段插入和/或缺失(indel)，进而造成基因突变。在存在同源序列的情况下,还可以通过同源重组的方式进行修复，以产生大片段的DNA精确删除或者是外源DNA的插入。

ZFN作为第一种人工构建并成功应用的EEN，大大促进了基因组靶向修饰技术。李宁等利用ZFN在牛胎儿成纤维细胞中介导的NHEJ修复途径生产了BLG基因部分缺失的牛，然而其读码框阅读顺序并没有改变，所以并没能完全敲除掉BLG。然而，由于ZFN的构建比较困难且费用较高，以及其脱靶效应的存在，该技术并没有在家畜动物中广泛使用。

TALEN既能够像ZFN一样精确地修饰复杂的基因组，又具有比ZFN更容易设计的优点，且其脱靶率以及细胞毒性更低。应用TALEN介导的基因组修饰已成功应用于多种模式动物，如果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠等。Daniel F.Carlson等将TALEN与含有筛选标记的辅助载体共同转染家畜体细胞，以通过药物筛选富集含有基因修饰的突变体。由于这种方法获得的修饰为随机的、不可预测的，使得筛选具有功能缺失的突变体的工作量十分复杂。此外，辅助载体的随机整合对生物个体的安全存在极大的影响。

发明内容