[发明专利]一种重组蛋白及其在昆虫杆状病毒表达系统中的表达方法

权利要求书

1.一种重组HBV pre-c-Fc蛋白质分子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种DNA分子，其编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

3.一种重组载体，其特征在于，其含有权利要求2所述的DNA分子和与所述DNA分子连接的用于表达的调节序列。

4.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求2所述的DNA分子。

5.一种获得重组杆状病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、对如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列进行密码子优化得到如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，之后通过人工合成如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列并将其构建到pUC57质粒上得到pUC57HBV pre-c-Fc重组载体；之后进入步骤二，

步骤二、以pUC57HBV pre-c-Fc重组载体为模板，利用如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的基因片段并将其构建到pFastBac质粒上以得到pFastBac-HBV pre-c-Fc重组载体；之后进入步骤三，

步骤三、利用步骤二得到的pFastBac-HBV pre-c-Fc重组载体转座含有Bacmid质粒的E.Coli DH10Bac感受态细胞中，从而使其发生同源重组以得到Bacmid-HBV pre-c-Fc重组载体；之后进入步骤四，

步骤四，利用Bacmid-HBV pre-c-Fc重组质粒转染昆虫细胞以得到第一代重组杆状病毒。

6.如权利要求5所述的获得重组杆状病毒的方法，其特征在于，在所述步骤四之后还包括步骤五：

将步骤四中得到的第一代重组杆状病毒转染昆虫细胞以表达得到第二代重组杆状病毒，之后再利用同样的方法直到得到第四代重组杆状病毒。

7.如权利要求5所述的获得重组杆状病毒的方法，其特征在于，所述步骤四中，利用Bacmid-HBV pre-c-Fc重组质粒转染昆虫细胞以得到第一代重组杆状病毒的具体过程为：

(4.1)从含有Bacmid-HBV pre-c-Fc载体的E coli DH5α菌株中提取Bacmid-HBV pre-c-Fc质粒；

(4.2)取对数生长期的Sf9细胞，加入到六孔板中，每孔8×10⁵个；

(4.3)静置30min使得Sf9细胞贴于下壁；

(4.4)取8μl细胞转染试剂加入到100μl的昆虫细胞培养基中混匀，取1μl Bacmid-HBV pre-c-Fc质粒加入到100μl昆虫细胞培养基中混匀，然后将两种混合液混合，即得到转染混合物；

(4.5)将转染混合物滴加到细胞中，27℃孵育3-5小时；

(4.6)弃去转染混合物，加入2ml新的昆虫细胞培养基，27℃

下培养72h；其中，所述昆虫细胞为Sf9细胞。

8.一种重组杆状病毒，其特征在于，由如权利要求5至7任一项所述的方法获得。

9.一种生产重组HBV pre-c-Fc蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：使用权利要求8所述的重组杆状病毒感染昆虫细胞，分离纯化产生的重组HBV pre-c-Fc蛋白。

10.权利要求8所述重组杆状病毒在制备预防或治疗乙型肝炎的疫苗或药物中的应用。