[发明专利]一种重组蛋白及其在昆虫杆状病毒表达系统中的表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组蛋白及其在昆虫杆状病毒表达系统中的表达方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是全球尤其是我国疾病负担之一：全世界超过2亿的人已经或正在感染乙型肝炎病毒，它能够引起肝炎、肝硬化乃至肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。据统计，每年约有78万人死于乙型肝炎及其引起的相关疾病中，严重危害人类的健康，影响人们的生活质量。HBV全基因组可编码多种病毒蛋白，深入探讨各种病毒蛋白的生物学功能对HBV感染相关疾病的发生机制的揭示和临床检测治疗的指导具有非常重要的意义。

目前，上市的乙肝疫苗大多数是HBV的表面抗原即s蛋白，但乙肝病毒逃逸现象仍然严重，相关研究表明乙肝病毒c蛋白和e蛋白与乙肝病毒逃逸现象的发生密切相关。乙肝病毒前c蛋白(hepatitis B virus precore,HBV pre-c)是乙型肝炎病毒c蛋白和e蛋白的前体，生物学功能尚不十分明确。相关研究表明，HBV pre-c蛋白与c蛋白结合形成的复合物可能有利于病毒的持续感染^[8]。

设计疫苗的关键在于能够有效地活化抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC)，促进抗原呈递和激活免疫反应。并且由于APC的表面能够表达FcR(Fc receptor)，所以抗原-Fc融合蛋白可以作为抗原的运载工具，借助Fc片段靶向作用结合APC，从而缩短抗原在血液中的游离时间，减少蛋白酶对抗原的降解，因而能够提高抗原半衰期，加强抗原的呈递。

1983年由smith等建立了具有蛋白表达水平高、对目的蛋白有翻译后修饰、周期短等优势的杆状病毒表达系统(baculovirus expression vector system,BEVS)。继2007年第一个被美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市的宫颈癌预防双价人乳头瘤病毒疫苗Cerearix批准上市，2013年美国FDA批准预防18～49岁人群季节性流感的疫苗FluBlok上市以来，杆状病毒表达系统现已广泛应用于疫苗的生产、生物制药和基因工程当中。

发明内容

针对以上发现，本发明运用杆状病毒表达系统表达乙型肝炎病毒前C蛋白-小鼠IgG Fc的融合蛋白作为疫苗，以获得具有免疫活性的重组蛋白，以大大减少乙肝病毒逃逸的问题，为慢性乙型肝炎的免疫治疗的研究奠定基础并开拓新的思路。

本发明的目的之一是提供一种HBV pre-c-Fc蛋白，其能够大大减少乙肝病毒逃逸现象，且由于该蛋白融合小鼠IgG Fc，能够缩短抗原在血液中的游离时间，减少蛋白酶对抗原的降解，提高抗原半衰期，加强抗原的呈递。

本发明的还有一个目的是提供一种重组杆状病毒，其能够成功表达HBV pre-c-Fc蛋白，并能够大规模生产HBV pre-c-Fc蛋白。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种重组HBV pre-c-Fc蛋白质分子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

一种DNA分子，其编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

一种重组载体，其含有所述的DNA分子和与所述DNA分子连接的用于表达的调节序列。

宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的DNA分子。

另一方面，提供了一种获得重组杆状病毒的方法，包括如下步骤：

步骤一、对如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列进行密码子优化得到如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，之后通过人工合成如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列并将其构建到pUC57质粒上得到pUC57 HBV pre-c-Fc重组载体；之后进入步骤二，

步骤二、以pUC57 HBV pre-c-Fc重组载体为模板，利用如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的基因片段并将其构建到pFastBac质粒上以得到pFastBac-HBV pre-c-Fc重组载体；之后进入步骤三，

步骤三、利用步骤二得到的pFastBac-HBV pre-c-Fc重组载体转座含有Bacmid质粒的E.Coli DH10Bac感受态细胞中，从而使其发生同源重组以得到Bacmid-HBV pre-c-Fc重组载体；之后进入步骤四，