[发明专利]刺参BPI基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参BPI基因工程菌构建方法

权利要求书

1.一种刺参BPI基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO.1所示的cDNA序列。

2.一种权利要求1所述的刺参BPI基因的克隆方法，其特征在于步骤如下：根据与BPI基因同源的表达序列标签EST序列设计RACE的巢式引物，采用RACE技术扩增基因全长。

3.根据权利要求2所述的一种刺参BPI基因的克隆方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)通过对腐皮综合症发病刺参和健康刺参体腔细胞高通量转录组测序和表达谱分析，发现了多条编码BPI基因的EST序列，选取编码刺参BPI部分片段的EST克隆；

(2)RACE引物设计：根据编码刺参BPI部分片段的EST克隆设计RACE的巢式引物：3’上游特异性引物1：TTCAAAGCACAAAACAACCCGTC，3’上游特异性引物2：TGGGTGTCATCTTTTGAAGGTGT；5’下游特异性引物1：GCACTGTTGATGAGGTAGTCGCT，5’下游特异性引物2：GTGTCCGCAGTAAGGAGTAATCT，扩增3’接头引物Adaptor3：TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT，扩增5’接头引物Adaptor5：CATGGCTACATGCTGACAGCCTA；

(3)RACE扩增获取刺参BPI基因全长序列，具体步骤如下：

a.总RNA提取：通过刺参体腔液收集体腔细胞制备RNA提取液；

b.3’-RACE扩增：将RNA提取液用3’-Full RACE Core Set with PrimeScript^TM RTase试剂盒逆转录合成扩增3’的模板，以此为模板使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物进行PCR扩增，取PCR产物1μL作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物进行PCR扩增得到3’端目的条带；

c.5’-RACE扩增：将RNA提取液用5’-Full RACE Kit试剂盒逆转录合成扩增5’的模板，以此为模板使用5’下游特异性引物1和扩增5’接头引物进行PCR扩增，取PCR产物1μL作为模板，再用5’下游特异性引物2和扩增5’接头引物进行PCR扩增得到5’端目的条带；

d.将扩增产物3’端目的条带和5’端目的条带用凝胶回收试剂盒回收，回收产物与载体pMD18-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50μg/mL的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证并测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得到刺参BPI基因全长序列，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求3所述的一种刺参BPI基因的克隆方法，其特征在于上述RACE扩增反应体系及反应条件：模板1.0μL，不含Mg²⁺的10×PCR缓冲液2.5μL，浓度25mM的MgCl₂ 2.0μL，浓度2.5mM的dNTP 2.0μL，浓度10μM的特异性引物1.0μL，浓度10μM的接头引物1.0μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2μL，超纯水：15.3μL；扩增条件：94℃3min、94℃30s、60℃30s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

5.一种权利要求1所述的刺参BPI基因的编码蛋白，其特征在于该编码蛋白为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

6.一种权利要求5所述的刺参BPI基因编码蛋白的N端蛋白质，其特征在于该蛋白质为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

7.一种利用权利要求6所述的刺参BPI基因编码蛋白的N端蛋白质编码基因构建重组刺参BPI基因工程菌的方法，其特征在于步骤如下：设计PCR引物，用分别含有BamH I位点和Not I位点的引物扩增刺参BPI蛋白的N端结构域，即权利要求6所述的刺参BPI基因编码蛋白的N端蛋白质；将克隆得到的目的基因插入pET28a(+)载体，获得重组质粒pET28a(+)-BPIN；对重组质粒pET28a(+)-BPIN进行诱导表达，再进行纯化复性即获得基因工程菌。