[发明专利]刺参BPI基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参BPI基因工程菌构建方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学以及基因工程领域，尤其是涉及一种刺参BPI基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参BPI基因工程菌构建方法。

背景技术

杀菌通透性增强蛋白（Bactericidal/permeability-increasing protein，BPI）是嗜中性粒细胞（Polymorphonuclear neutrophils，PMNs）分泌的一种阳离子抗菌糖蛋白，具有选择性杀伤革兰氏阴性细菌（gram-negative bacteria，G^-）和中和内毒素等功能。BPI作为机体自身抗菌系统的一种产物，是迄今为止唯一被认为同时具有杀菌和中和内毒素两种功能的抗菌物质。研究发现BPI的N端片段具有与BPI同等的功能。BPI N端富含阳离子，能与内毒素的毒性成分类脂质A区域特异结合进而改变细菌细胞壁的通透性而杀死细菌。随着研究的深入，研究者发现BPI除具有杀菌和中和内毒素外，还具有抗革兰氏阳性菌和真菌，中和肝素，促进补体活化，以及抗血管生成和免疫调节等多种生物学功能，在机体内被称为“超级抗生素”。

目前，对BPI生物学功能的研究主要集中在人及其他哺乳动物，在低等脊椎动物和无脊椎动物中的研究相对甚少，BPI蛋白活性分析仅见于大黄鱼和牡蛎中。而此类抗菌物质的出现，不但为临床抗感染治疗提供了新的“武器”，而且为解决日趋严重的细菌耐药问题提供了新的思路。因此，深入研究主要水产养殖品种免疫防御机制，利用水产养殖动物自身抗菌物质，这样为解决海水养殖业病害预防，开展健康养殖和实现养殖业可持续发展具有重要意义。

刺参（Apostichopus japanicus），是属于棘皮动物门（Echinodermata）、海参纲（Holothuridea）、循手目（Aspidochirota）的重要经济种类，是一种高蛋白、低脂肪、低糖、无胆固醇的重要经济养殖水产动物。但由病原菌引发的疾病严重制约了该产业的健康和持续发展。目前在生产中大多使用抗生素和水体消毒剂防治，但抗生素的大量使用诱导致病菌产生耐药性，导致抗生素失效，水体消毒剂往往对刺参有较大的刺激作用。因此，构建水产动物抗菌肽基因表达工程菌，进而产业化高产量且价格低廉的生产天然抗菌药物已迫在眉睫。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种刺参BPI基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参BPI基因工程菌构建方法，表达的重组杀菌通透性增强蛋白N末端产物对副溶血弧菌，哈维氏弧菌，藤黄微球菌具有明显的杀菌作用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种刺参BPI基因，该基因具有SEQID NO.1所示的cDNA序列。该序列全长2208 bp，包括1455 bp的开放阅读框，编码484个氨基酸，5’非编码区长395 bp，3’非编码区长358 bp， 具有多聚腺苷酸信号，mRNA末端不稳定信号以及序列末端含有典型的polyA尾（通常位于mRNA上的150-200个腺苷酸残基）。

2、上述刺参BPI基因的克隆方法，根据与BPI基因同源的表达序列标签EST序列设计RACE的巢式引物，采用RACE技术扩增基因全长，具体步骤如下：

（1）通过对腐皮综合症发病刺参和健康刺参体腔细胞高通量转录组测序和表达谱分析，发现了多条编码BPI基因的EST序列（Pengjuan Zhang, Chenghua Li, Lin Zhu, Xiurong Su, Ye Li, Chunhua Jin, Taiwu Li. De Novo assembly of the sea cucumber Apostichopus japonicus hemocytes transcriptome to identify miRNA targets associated with skin ulceration syndrome. Plos ONE 2013. 8(9):e73506.），选取编码刺参BPI部分片段的EST克隆；