[发明专利]一种基于黄杆菌产维生素K2的生产工艺

权利要求书

1.一种基于黄杆菌产维生素K₂的生产工艺，其特征在于，包括如下步骤：

(1)、一级培养：取黄杆菌试管斜面一环，接种于一级种子培养基中培养12-24h，该一级种子培养基的组成为：麦芽糖20-30g/L、牛肉膏10-20g/、L、K₂HPO₄ 4-5g/L、NaCl 3-4g/L、MgSO_4·7H₂O 0.3-0.5g/L，且该一级种子培养基的pH为7.0；

(2)、二级培养：取步骤(1)的一级种子瓶培养液，按3-8％接种量接种于二级种子培养基中培养24-36h，该二级种子培养基的组成为：麦芽糖10-20g/L、酵母浸膏5-15g/L、K₂HPO₄ 2-4g/L、NaCl 2-3g/L、MgSO_4·7H₂O 0.2-0.4g/L、且该二级种子培养基的pH为7.0；

(3)、发酵培养：取步骤(2)中的二级种子瓶培养液，按5-10％接种量接种于500ml摇瓶或3.7L-30L发酵罐中，培养8-48h后，添加0.005-5％表面活性剂继续发酵培养120-200h；

(4)、胞内产物提取：将步骤(3)得到的发酵液离心弃上清，菌体真空冷冻干燥后，加入甲醇萃取，采用高效液相色谱法分析测定；

(5)、胞外产物提取：将步骤(3)得到的发酵液以15000r/min离心旋转10min，取上清，加入同等体积的正丁醇，漩涡震荡10min，混匀后再以10000r/min离心旋转5min，取上层有机相采用高效液相色谱法分析测定。

2.根据权利要求1所述的一种基于黄杆菌产维生素K₂的生产工艺，其特征在于，

步骤(3)中加入的表面活性剂选自阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和两性离子型表面活性剂中的一种或几种。

3.根据权利要求2所述的一种基于黄杆菌产维生素K₂的生产工艺，其特征在于，所述阳离子型表面活性剂选自脱氢枞胺(DA)、十二烷基三甲基溴化铵(DTA)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或三乙醇胺(TEA)。

4.根据权利要求2所述的一种基于黄杆菌产维生素K₂的生产工艺，其特征在于：所述阴离子型表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、月桂醇硫酸钠、十二烷基苯磺或十二烷基硫酸铵。

5.根据权利要求2所述的一种基于黄杆菌产维生素K₂的生产工艺，其特征在于：所述非离子型表面活性剂选自Tween-60、Tween-80、APG、TtitonX-100或OP-10。

6.根据权利要求2所述的一种基于黄杆菌产维生素K₂的生产工艺，其特征在于：所述两性离子型表面活性剂选自烷基二甲基甜菜碱、烷基二甲基磺乙基甜菜碱、烷基二甲基羟丙基磷酸脂甜菜碱或十二烷基氨基丙酸。

7.根据权利要求1所述的一种基于黄杆菌产维生素K₂的生产工艺，其特征在于,包括如下步骤:(1)、一级培养：取黄杆菌试管斜面一环，接种于一级种子培养基中培养24h，该一级种子培养基的组成为：麦芽糖30g/L、牛肉膏10g/L、K₂HPO₄ 5g/L、NaCl 4g/L、MgSO_4·7H₂O0.4g/L，且该一级种子培养基的pH为7.0；

(2)、二级培养：取步骤(1)的一级种子培养液，按5％接种量接种于二级种子培养基中培养24h，该二级种子培养基的组成为：麦芽糖20g/L、酵母浸膏5g/L、K₂HPO₄ 2g/L、NaCl 2g/L、MgSO_4·7H₂O0.4g/L，且该二级种子培养基的pH为7.0；

(3)、发酵培养：取步骤(2)中的二级种子瓶培养液，按10％接种量接种于30L发酵罐，发酵培养24h后，添加TritonX-10为0.1％，发酵30h后，加入Tween-80为1％，继续发酵培养200h提取发酵产物；

(4)、胞内产物提取：将步骤(3)得到的发酵液离心弃上清，菌体真空冷冻干燥后，加入甲醇萃取，采用高效液相色谱法分析测定；

(5)、胞外产物提取：将步骤(3)得到的发酵液以15000r/min离心旋转10min，取上清，加入同等体积的正丁醇，漩涡震荡10min，混匀后再以10000r/min离心旋转5min，取上层有机相采用高效液相色谱法分析测定。