[发明专利]一种基于黄杆菌产维生素K2的生产工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于黄杆菌产维生素K₂的生产工艺，通过添加表面活性剂改变细胞膜通透性，解除胞内产物的反馈抑制，有效提高黄杆菌产维生素K₂发酵能力。

背景技术

维生素K又称抗出血维生素，是具有叶绿醌生物活性的α-甲基-1,4-萘醌衍生物的总称，体内包括维生素K₁和维生素K₂。维生素K₂(简写为MK-n)为系列化合物，统称为甲基萘醌类，其侧链有一不饱和的多异戊二烯基，根据侧链长短的不同有多种形式，最常见的是侧链上有4～10个类异戊二烯基的甲基萘醌(从MK-4到MK-10)。维生素K₂具有多种生理功能，如维生素K₂可促进凝血酶原的形成，维持机体的正常凝血，可以通过促进谷氨酸残基羧化成γ-羧化谷氨酸残基促进骨骼形成，还具有利尿、强化肝脏的解毒功能，预防肝硬化发展为肝癌等多种生理功能。神经科学家Patrik Verstreken研究小组发现维生素K₂能恢复导致帕金森氏症的一个遗传缺陷的影响，为帕金森氏患者带来新希望。帕金森疾病中pink1基因突变会影响线粒体功能，果蝇中的UBIAD1/Heix是pink1的调节基因，维生素K₂能恢复Heix突变引起的严重线粒体缺陷。表明维生素K₂在医药工业上有进一步的应用潜力。

黄杆菌属革兰氏阴性菌，能够发酵生产维生素K₂，主要合成MK-4和MK-6，其维生素K₂的合成主要发生在胞内，而胞内发酵产物的合成量往往受到不断累积的产物的反馈抑制，如果在不影响菌体生长的基础上，能使胞内发酵产物不断溢出到胞外可避免反馈抑制，控制代谢流流向目标产物，对于提高黄杆菌胞内胞外维生素K₂的总产量具有重要意义。

表面活性剂由于其独特的结构特征，具有增加细菌细胞膜通透性的作用，可使代谢产物分泌到细胞外，消除代谢产物的负反馈作用，使产物在发酵液中积累，最终达到了提高产率的目的。目前，表面活性剂作为发酵促进剂主要致力于诱发谷氨酸分泌的机理方面的研究。渗漏模型(leak model)是普遍接受的机制。1968年，Takinami等根据生物素和脂肪酸与谷氨酸积累的相互关系的研究结果认为，生物素的缺乏降低了脂肪酸合成酶活性，引起磷脂含量的减少并改变磷脂和脂肪酸的组成，导致磷脂双分子层物理性质的改变，对谷氨酸具有可透性，引起谷氨酸被动扩散的溢出降低了胞内浓度，使胞内谷氨酸浓度控制在某一规定水平下而解除谷氨酸的反馈抑制，于是菌体细胞继续合成谷氨酸并分泌出去。Huchenq等发现表面活性剂抑制了细胞膜脂肪酸的合成，从而改变了细胞膜的组成成分，改变其通透性，使产生的谷氨酸能更好的渗透到细胞外。Duperray等通过加入两种季铵盐表面活性剂(DA、DTA)，研究谷氨酸分泌到细胞外的诱发机制，结果表明季铵盐类表面活性剂可以有效提高谷氨酸的分泌量。非离子表面活性剂毒性较小，几乎不影响菌体的生长，在保证生物量不变的前提下，非离子表面活性剂对促进营养物质的传递吸收，提高维生素K₂的产量具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于黄杆菌产维生素K₂的生产工艺。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种基于黄杆菌产维生素K₂的生产工艺，包括如下步骤：

(1)、一级培养：取黄杆菌试管斜面一环，接种于一级种子培养基中培养12-24h，该一级种子培养基的组成为：麦芽糖20-30g/L、牛肉膏10-20g/、L、K₂HPO₄4-5g/L、NaCl 3-4g/L、MgSO_4·7H₂O 0.3-0.5g/L，且该一级种子培养基的pH为7.0；

(2)、二级培养：取步骤(1)的一级种子瓶培养液，按3-8％接种量接种于二级种子培养基中培养24-36h，该二级种子培养基的组成为：麦芽糖10-20g/L、酵母浸膏5-15g/L、K₂HPO₄2-4g/L、NaCl 2-3g/L、MgSO_4·7H₂O 0.2-0.4g/L、且该二级种子培养基的pH为7.0；