[发明专利]一种土壤中微生物多样性的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种土壤中微生物多样性的分析方法，属于土壤微生物分析技术领域。

背景技术

目前，对于土壤微生物多样性的研究主要是借助于分子生物学的手段，直接从土壤中获得微生物的DNA片段进行分析，从而使环境微生物多样性分析成为一种尽可能全面的方法。近年来，关于土壤中微生物多样性分析的方法报道很多。然而，主要侧重于提取土壤中细菌群落的总DNA的提取及分析，较少关注土壤中真菌群落总DNA的提取及分析。对于土壤细菌与真菌多样性研究目前普遍采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析。如中国专利申请(公开号：CN102399855A)公开了一种检测土壤微生物多样性的分析方法，包括从土壤中进行DNA提取、测出DNA提取液中DNA的浓度和纯度，再进行PCR特异性扩增和对扩增产物进行变性梯度凝胶电泳分析。虽然，常规的DGGE方法是一种公认的方法，可以获得相对来说较精确的检测结果，但是，该方法需要跑胶，费时费力，检测过程中用时较长，且变性凝胶中采用的甲酰胺与丙烯酰胺具有毒性，同时为了提高灵敏度需要采用同位素标记引物，存在放射性污染，且不利于实际操作。

发明内容

本发明针对以上现有技术中存在的缺陷，提出一种土壤中微生物多样性的分析方法，解决的问题是实现具有污染小和耗时少的效果。

本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的，一种土壤中微生物多样性的分析方法，该方法包括以下步骤：

A、对采集的土壤进行微生物基因组DNA提取，得到基因组DNA提取液；

B、对基因组DNA提取液进行检测确定土壤基因组DNA的浓度和纯度；

C、将从土壤中提取的DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

D、采用变性高效液相色谱对PCR扩增产物进行微生物多样性分析。

本发明的一种土壤中微生物多样性的分析方法，通过采用变性高效液相色谱法代替传统的DGGE法，通过采用变性高效液相色谱法来分析细菌核糖体小亚基16S rDNA与真菌核糖体小亚基18S rDNA的保守序列的片段多少，并通过计算多样性指数来表征土壤细菌与真菌多样性的情况，从而实现无需对引物进行标记，也无需采用含有毒性物质甲酰胺和丙烯酰胺进行跑胶，减少了放射性污染，具有污染小的效果；同时，采用变性高效液相色谱法可以实现高度的自动化，检测时间短，使具有较高的灵敏度和检测用时少的效果。

在上述的土壤中微生物多样性的分析方法中，作为优选，步骤D所述变性高效液相色谱为WAVE核苷酸片段分析仪。本领域常规的是用于分离核苷酸片段和检测已知基因突变的技术平台，目前还没有发现在土壤微生物多样性分析方面的应用。而本发明通过采用WAVE核苷酸片段分析仪不仅能够分析土壤中细菌核糖体小亚基16S rDNA与真菌核糖体小亚基18S rDNA的保守序列的片段多少，是为了确定土壤中微生物的多样性分布情况，从而更准确的反应出土壤中的微生物结构的作用，且还较具有高灵敏度和重复性好的效果；另外，还具有高度的自动化，可以实现自动取样，检测每个样品只需要15分钟左右即可完成检测，还能够适应大批量的样品分析。当然，也可以采用其它的核苷酸片段分析仪替代WAVE核苷酸片段分析仪进行分析，如Agilent 2100核苷酸片段分析仪等。

在上述的土壤中微生物多样性的分析方法中，步骤D中所述微生物包括细菌和真菌。本发明的方法能够比较全面的提取出土壤微生物中细菌和真菌群落，且采用变性高效液相色谱分析法也能够全面的分析出土壤中细菌和真菌的情况，从而能够较好的反应出土壤中真实的微生物群落结构。

在上述的土壤中微生物多样性的分析方法中，作为优选，步骤D中采用WAVE核苷酸片段分析仪对PCR扩增产物进行真菌多样性分析的变性温度为55℃～57℃。作为优选，步骤D中采用WAVE核苷酸片段分析仪对PCR扩增产物进行细菌多样性分析的变性温度为60℃～63℃。由于不同的变性温度条件，DNA双链会形成不同的解链状态。变性温度的确定有利于将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开，而可变性温度与DNA分子间的解链温度(Tm)有关，微生物物种确定时，其变性温度是固定的。但土壤微生物由于种类较多，所以很验证获得确定的变性温度，需要通过实验摸索来确定较适的变性温度，以获得稳定的条带分离效果，使实验结果具有稳定性、可靠性与可重复性。通过采用本发明的变性温度能够很好的与采用的WAVE核苷酸片段分析仪起到较好的结合作用，如果温度过低，DNA不能完全变性，条带不能很好地分离；而如果温度过高，DNA变性为单链DNA的过程太快，也会导致条带不能很好地分离，不利于土壤中微生物的分析。