[发明专利]一种高效表达重组利拉鲁肽的方法

权利要求书

1.一种高效表达重组利拉鲁肽的表达基因片段HIS₆-EK-利拉鲁肽，该表达基因片段的序列如SEQ ID NO：1所示。

2.含有权利要求1所述的表达基因片段的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于该重组表达载体为所述的基因片段克隆进入PET-22b载体中获得重组表达载体PET-22b-HIS₆-EK-利拉鲁肽。

4.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于该重组表达载体采用将分子伴侣troponin C SEQ ID NO：2全长基因连接到所述的基因片段HIS₆-EK-利拉鲁肽的5`末端，最后一起克隆进入pET-22b载体，即重组为表达载体pET-22b-troponin C-HIS₆-EK-利拉鲁肽。

5.含有权利要求1所述的表达基因片段的菌株，其特征在于：该菌株采用权利要求4所述的表达载体pET-22b-troponin C-HIS₆-EK-利拉鲁肽转入到大肠杆菌DE3菌株中，用IPTG储液诱导重组基因的表达，离心收集菌体。

6.权利要求5所示的菌株用于重组利拉鲁肽的高效表达。

7.一种高效表达重组利拉鲁肽的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1)根据利拉鲁肽基因序设计引物，并替换掉大肠杆菌不利表达的密码子以获得优化的基因序列，基因序列5`末端依次增加两段基因序列，分别为肠激蛋白酶切位点序列EK和HIS标签序列HIS<sub>6</sub>，得到表达基因片段HIS<sub>6</sub>-EK-利拉鲁肽，表达基因片段HIS<sub>6</sub>-EK-利拉鲁肽的序列如SEQ ID NO：1所示；并将基因片段克隆进入PET-22b载体中即为重组表达载体PET-22b-HIS<sub>6</sub>-EK-利拉鲁肽，相应表达出的重组蛋白为PET-22b-HIS<sub>6</sub>-EK-利拉鲁肽；接着再将分子伴侣troponin C SEQ ID NO：2全长基因序列克隆出来，然后将其连接到基因片段HIS<sub>6</sub>-EK-利拉鲁肽的5`末端，最后一起克隆进入pET-22b载体，即重组为表达载体pET-22b-troponin C-HIS₆-EK-利拉鲁肽，相应表达出的重组蛋白为troponin C-HIS₆-EK-利拉鲁肽；

2)将步骤1)中构建好的表达载体pET-22b-troponin C-HIS₆-EK-利拉鲁肽转入到大肠杆菌DE3菌株中，用IPTG储液诱导重组基因的表达，离心收集菌体；PB缓冲液重悬得到的菌体，超声破碎，离心收集上清液；

3)将2)中得到的troponin C-HIS₆-EK-利拉鲁肽蛋白进行初步纯化，通过阳离子交换树脂进行纯化，缓冲液为PB，20mM，PH7.5，将troponin C-HIS₆-EK-利拉鲁肽蛋白用盐离子浓度洗脱并收集；

4)将收集洗脱得到的目的蛋白进行镍离子亲和层析，通过HIS标签，将目的蛋白吸附在镍离子亲和柱上，再用高浓度咪唑进行洗脱；

5)将洗脱蛋白进行脱盐，平衡液为20mM PB；用EK酶酶切，4℃过夜酶切；

6)最后将酶切产物蛋白经过亲和层析，缓冲液同前，将融合蛋白和利拉鲁肽蛋白进行分离，流穿的为目的蛋白，洗脱的为杂蛋白。

8.根据权利要求7所述的一种高效表达重组利拉鲁肽的方法，其特征在于：将脱盐得到的含有troponin C-HIS₆-EK-利拉鲁肽蛋白的溶液调整到pH为6.0，加入肠激蛋白酶进一步酶切。