[发明专利]缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及小分子荧光探针技术领域，特别涉及缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法。

背景技术

亲和素作为一种生物蛋白质，在肿瘤/癌细胞中出现的机率比在正常细胞出现的机率要高很多，对亲和素的定性和定量检测相应地可作为肿瘤细胞诊断的重要依据之一。此外生物素与亲和素之间的这种强亲和专一性相互作用，广泛用于生物分析领域，如酶联免疫也就是ELISA法测定、生物分子识别、肿瘤细胞诊断等。因此，开发高灵敏和选择性地检测亲和素的探针成为研究的焦点。

近年来，荧光探针由于其具有选择性好、灵敏度高、响应时间快、可实现原位检测的优点，在生物分子检测方面得到很好的应用。但理想的亲和素荧光探针分子应该自身荧光很弱或最好不发荧光，只有当亲和素存在下才发光，产生显著的荧光增强，实现高灵敏性检测。

亲和素蛋白含有疏水性空腔，荧光探针如与亲和素通过疏水性相互作用，探针分子可从水溶液进入疏水性空腔。作用前后染料所处环境发生改变，诱导荧光产生[Zhuang,Y.；Chiang,P.；Wang,C.；TanK.Angew.Chem.Int.Ed.,2013,52,8124-8128.]。虽然可以选择环境敏感的荧光探针分子来调控其自身荧光，实现显著荧光增强，但是大多数染料不具有荧光环境敏感的特性。虽然大多数染料具有聚集诱导的荧光淬灭(ACQ)特性，可通过调控染料聚集降低探针分子的自身荧光，如罗丹明、荧光素与生物素相连得到的亲和素荧光探针，可实现显著荧光增强，但这些荧光探针需要引入合适的亲疏水基团来调控染料聚集，以期达到降低探针分子自身荧光的目的[(a)Mizusawa,K.；Ishida,Y.；Takaoka,Y.；Miyagawa,M.；Tsukiji,S.；Hamachi,I.J.Am.Chem.Soc.2010,132,7291-7293.(b)Mizusawa,K.；Takaoka,Y.；Hamachi,I.J.Am.Chem.Soc.2012,134,13386-13395.]。因此需要复杂的有机合成，此外引入的这些基团可能会影响探针与亲和素的特异性作用，最终影响检测结果。目前大部分亲和素荧光探针分子处于短波长区，激发时会对生物组织产生损伤，在该检测区域生物体自发荧光也对检测产生严重干扰，使其在实际应用中受到一定的限制。因此研究开发在缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针具有重要理论和实际应用价值。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法，能够克服现有的荧光探针性能上的不足之处，且具有合成简单、检验灵敏准确的特点。

为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：

缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法，将方酸菁染料(SQ)和二胺类物质加入到无水二氯甲烷溶剂中，室温下搅拌，制备得到中间产物SQ-n-NH₂，其中，n为二胺类物质中C原子数量的一半；

将制备得到的中间产物SQ-n-NH₂和三乙胺加入到无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂中混合，制备得到混合液A，其中，SQ-n-NH₂、三乙胺与无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂的摩尔比为1：0.19：166；将溶有N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的无水N,N'-二甲基甲 酰胺溶液逐滴加入到上述混合液A中，其中，溶有N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶液与混合液A的摩尔比为1：160.8，室温环境下搅拌过夜，得到近红外荧光探针。

具体的，将方酸菁染料(SQ)和二胺类物质加入到无水二氯甲烷溶剂中，在氮气流保护下，室温环境中搅拌，然后蒸除无水二氯甲烷溶剂后得到中间产物SQ-n-NH₂，所述中间产物SQ-n-NH₂为粗品SQ-n-NH₂，粗品SQ-n-NH₂不经纯化直接用于下一步反应；