[发明专利]高通量的多年生黑麦草农杆菌转化体系及其专用试剂盒

权利要求书

1.一种用于多年生黑麦草农杆菌转化的专用试剂盒，其特征在于，包括发芽培养基、诱导培养基I、诱导培养基II、分化培养基、保持培养基、侵染液、共培养基、筛选培养基I、筛选培养基II、再生培养基和生根培养基；

所述发芽培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为30g/L的蔗糖和3g/L凝固剂；

所述诱导培养基I为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为22.6μM的2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；

所述诱导培养基II为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖和3g/L的凝固剂；

所述分化培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为4.4μM的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L麦芽糖和3g/L的凝固剂；

所述保持培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为8.8μM的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；

所述侵染液为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为10g/L的葡萄糖和50g/L的蔗糖；

所述共培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、400μM的乙酰丁香酮、10g/L的葡萄糖、70g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；

所述筛选培养基I为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、50mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L蔗糖的和3g/L的凝固剂；

所述筛选培养基II为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、75mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；

所述再生培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为4.4μM的6-苄氨基腺嘌呤、25mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L的麦芽糖和3g/L的凝固剂；

所述生根培养基为1/2MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为30g/L的蔗糖和3g/的L凝固剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述侵染液和共培养基的pH值为5.2，所述其他各培养基的pH值均为5.8。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述凝固剂为植物凝胶。

4.一种权利要求1～3任一项所述的试剂盒用于多年生黑麦草农杆菌的转化的方法。

5.根据权利要求4所述的转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)黑麦草“Impact”和“Evening Shade”的品系的遴选：

将多年生黑麦草品种“Impact”和“Evening Shade”种子进行脱壳和表面消毒后置于所述发芽培养基中培养，得到分生组织；将分生组织纵向解剖一分为二置于所述诱导培养基I上，诱导出黄色致密的胚性愈伤组织；将所述黄色致密的愈伤组织移至所述分化培养基上，遴选出再生性良好的品系；

2)胚性愈伤组织的诱导：

将所述遴选出的再生性良好的品系的愈伤组织上分化出的绿头移至所述保持培养基上，得到丛生芽；将所述丛生芽的分生组织横向切下，依次接种于所述诱导培养基I和所述诱导培养基II上进行培养，得到胚性愈伤组织；

3)制备侵染用菌液：

先将重组农杆菌悬浮在所述侵染液中得到重悬菌液，再将所述重悬菌液中添加终浓度为400μM的乙酰丁香酮，得到侵染用菌液；

4)转化和筛选

将所述胚性愈伤组织和所述侵染用菌液混匀、连续摇动，将所述胚性愈伤组织取出晾干，得到侵染后的胚性愈伤组织，将所述侵染后的胚性愈伤组织在所述共培养培养基中进行共培养，共培养后依次移至所述筛选培养基I、II上，得筛选后的愈伤组织；将所述筛选后愈伤组织在所述再生培养基进行分化再生，至长出绿苗；

5)生根和壮苗

将所述长出绿苗的愈伤组织转至所述生根培养基上进行生根培养，待生根后进一步移栽至土壤中壮苗，即得到转基因多年生黑麦草。