[发明专利]高通量的多年生黑麦草农杆菌转化体系及其专用试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种高通量获得多年生黑麦草农杆菌转化的试剂盒和转化方法。

背景技术

多年生黑麦草(Lolium perenne L.)是世界上最重要的温带牧草之一(Jauhar 1993)，仅新西兰的种植面积就已超过700多万公顷(Siegal et al.1985)。同时多年生黑麦草又是一种异型杂交、风媒和高度自交不亲和的物种(Thorogood et al.2002)。因其高度自交不亲和性使得传统杂交育种在黑麦草优良品种的培育面前显得无计可施。而迅速崛起的生物技术育种度身定造般的弥补了此类空缺。通过高通量的农杆菌介导技术获得多年生黑麦草优良品种，对于改善动物的营养均衡、提高牛奶的产量和品质、增大乳品行业的利益，乃至改良人工草坪、防风固沙、保持水土、改善人类生存环境等都具有举足轻重的作用。

与其他单子叶植物相似，黑麦草属不是农杆菌的天然宿主。而农杆菌介导法比其他物理轰击法能更高效地获得了具备低拷贝、完整引入、稳定表达特性的转基因植株(Luo et al.2003；Han et al.2005)。到目前为止有关农杆菌转化多年生黑麦草的成功案例少之又少(Bettany et al.2003；Wu et al.2005；Bajaj et al.2006；Zhang et al.2012)。随着其他单子叶植物转化体系的突破，筛选组培效应敏感的基因型、优化培养基配方、简化转化流程，以期获得高效、稳定的遗传转化体系，为甄别影响产业性状的目标基因奠定了基础。

发明内容

为解决现有技术中无法用农杆菌对多年生黑麦草进行转化的缺陷，本发明提供一种多年生黑麦草农杆菌转化的试剂盒和转化方法。本发明的第一个目的为提供一种多年生黑麦草农杆菌转化的试剂盒，其具体组成如下：

本发明所述试剂盒依次包括发芽培养基、诱导培养基I、诱导培养基II、分化培养基、保持培养基、侵染液、共培养基、筛选培养基I、筛选培养基II、再生培养基和生根培养基；

所述发芽培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为30g/L的蔗糖和3g/L凝固剂；

所述诱导培养基I为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为22.6μM的2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；

所述诱导培养基II为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖和3g/L的凝固剂；

所述分化培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为4.4μM的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L麦芽糖和3g/L的凝固剂；

所述保持培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为8.8μM的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；

所述侵染液为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为10g/L的葡萄糖和50g/L的蔗糖；

所述共培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、400μM的乙酰丁香酮、10g/L的葡萄糖、70g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；

所述筛选培养基I为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、50mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L蔗糖的和3g/L的凝固剂；

所述筛选培养基II为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、75mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；

所述再生培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为4.4μM的6-苄氨基腺嘌呤、25mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L的麦芽糖和3g/L的凝固剂；

所述生根培养基为1/2MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为30g/L的蔗糖和3g/的L凝固剂。

本发明中，所述凝固剂为植物凝胶。

本发明中，所述侵染液和共培养基的pH值为5.2，所述其他各培养基的pH值均为5.8。

本发明中所述的试剂盒可应用于多年生黑麦草农杆菌的转化。