[发明专利]一种沉默DF‑1细胞系中IFNAR2基因的方法

权利要求书

1.一种沉默DF-1细胞系中IFNAR2基因的方法，其特征是，

(1)根据IFNAR2基因，设计RNA干扰靶点序列的多个siRNA，进一步筛选出mRNA水平上敲低IFNAR2基因表达的siRNA，筛选得到的siRNA的DNA序列为5′-TA CACAAGGCGTGATATCGTA-3′；

(2)构建表达上述筛选的IFNAR2基因siRNA的慢病毒载体LV-IFNAR2-RNAi；

所述慢病毒载体为LV-IFNAR2-RNAi的构建方法为：

1)根据筛选的siRNA的DNA序列设计合成单链DNA oligo，退火配对产生双链，再通过两端所含的酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体GV248中，将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，PCR方法鉴定阳性重组质粒GV248-IFNAR2；

所述双链为：

IFNAR2-RNAi-1：5′-CCGG TACACAAGGCGTGATATCGTA CTCGAG TACGATATCACGCCTTGTGTA TTTTTG-3′；

IFNAR2-RNAi-2：5′-AATTCAAAAA TACACAAGGCGTGATATCGTA CTCGAG TACGATATCACGCCTTGTGTA-3′；

2)大量提取重组质粒GV248-IFNAR2，与辅助质粒pHelper1.0、pHelper2.0混合后通过脂质体转染293T细胞，收集培养48h的细胞上清液，经离心，上清液过滤后得到慢病毒载体LV-IFNAR2-RNAi；

(3)通过上述慢病毒载体，将IFNAR2基因siRNA导入DF-1细胞系，沉默IFNAR2基因的表达，提高H5N2型禽流感病毒在DF-1细胞系中的增殖滴度。

2.如权利要求1所述的一种沉默DF-1细胞系中IFNAR2基因的方法，其特征是，所述脂质体为Lipofectamine2000。

3.如权利要求1所述的一种沉默DF-1细胞系中IFNAR2基因的方法，其特征是，所述步骤(3)具体包括以下步骤：

1)将DF-1细胞接种至细胞培养皿中，待生长密度达70％时，接种慢病毒LV-IFNAR2-RNAi；

2)以含10μg/mL聚凝胺的10％FBS DMEM培养基稀释LV-IFNAR2-RNAi至终浓度为5×10⁶PFU/mL，进而通过10倍倍比稀释，获得至少3个不同的病毒滴度，分别接种至DF-1细胞中；同时设定阳性病毒对照；

3)将接种LV-IFNAR2-RNAi的DF-1细胞置37℃条件下5％CO₂维持培养4h，更换为含5％FBS DMEM培养基，继续培养至48h，更换含4μg/mL嘌呤霉素的10％FBS DMEM培养基，筛选出阳性细胞克隆。