[发明专利]一种沉默DF‑1细胞系中IFNAR2基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种沉默DF-1细胞系中干扰素受体2(Interferon receptor 2，IFNAR2)基因的方法，用于提高禽流感病毒在该细胞系中的增殖滴度，属于生物技术领域。

背景技术

随着集约化养殖业的迅猛发展，禽流感等家禽重要疫病正成为公共卫生安全领域的焦点，从源头上控制疫病是当前防控策略的重中之重。实践证明，疫苗免疫和快速检测是防控重大动物疫病最有效的措施。由于禽流感病毒细胞培养的滴度较低，目前国内仍主要采用禽胚生产疫苗，效率低、耗能高，存在外源病毒的污染的可能。我国农业“十二五”规划已将重大动物疫病防控技术研究和农产品安全生产与质量控制技术研究列入重大关键技术攻关。

DF-1细胞是一种稳定的、无肿瘤基因的、可传代的鸡胚成纤维细胞系，细胞形态呈纤维状，该细胞缺少禽白血病病毒，肉瘤病毒内源性基因，被广泛用于动物病毒研究、疫苗研制及癌症研究等诸多领域。干扰素(Interferon，IFN)是机体细胞受到病毒或其他诱生剂作用而产生的具有抗病毒、免疫调节、抗细胞增殖等生物学活性的分泌型糖蛋白，主要分为IFN-α、IFN-β、IFN-γ。其中IFN-α、IFN-β的细胞表面受体为I型IFNAR，由IFNAR1和IFNAR2两条链组成，其中IFNAR1是IFNAR的一个重要亚单位蛋白，仅有1个亚单位，IFNAR2由3个亚单位组成，IFNAR1和IFNAR2形成异二聚体共表达时才能介导信号转导，单独存在不能发挥生物学功能。研究表明，IFN与细胞表面受体特异性结合经JAK-STAT途径介导信号传导，通过PKR、Mx和ADAR-1等途径发挥抗病毒作用。因此，建立一种沉默DF-1细胞系中IFNAR2基因的方法，可有效提高禽流感病毒在DF-1细胞系中的增殖滴度，从而降低疫苗生产成本，对于我国禽流感的预防和控制具有重要现实意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有禽流感疫苗生产中存在的不足，提供一种沉默DF-1细胞系中IFNAR2基因的方法，可提高禽流感病毒在DF-1细胞系中的抗原量达5-10倍，不仅可以解决疫苗抗原量不足以及生产成本较高的问题，而且推动禽流感生物反应器细胞培养技术的研发进程。

本发明的技术方案是：一种沉默DF-1细胞系中IFNAR2基因的方法，其特征是：

(1)根据IFNAR2基因，设计RNA干扰靶点序列的多个siRNA，进一步筛选出mRNA水平上敲低IFNAR2基因表达的siRNA；

(2)构建表达上述筛选的IFNAR2基因siRNA(IFNAR2RNAi基因)的慢病毒载体；

(3)通过上述慢病毒载体，将IFNAR2基因siRNA(IFNAR2RNAi基因)导入DF-1细胞系，沉默IFNAR2基因的表达，提高禽流感病毒在DF-1细胞系中的增殖滴度。

进一步地，所述步骤(1)的筛选方法是：将设计的多个siRNA插入pLKO.1-TRC克隆载体中，转染DF1细胞，再收获并提取细胞总RNA，采用荧光定量PCR方法筛选mRNA水平干扰IFNAR2基因的有效siRNA。

进一步地，所述步骤(1)筛选得到的siRNA为sh3：5′-TACACAAGGCGTGATATCGTA-3′；

进一步地，所述步骤(2)的慢病毒载体为LV-IFNAR2-RNAi；

上述慢病毒载体的构建方法为，包括以下步骤：

1)根据上述siRNA的DNA序列设计合成单链DNA oligo，退火配对产生双链，再通过两端所含的酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体GV248中，将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，PCR方法鉴定阳性重组质粒GV248-IFNAR2；

上述双链为：

IFNAR2-RNAi-1：5′-CCGG TACACAAGGCGTGATATCGTA CTCGAG TACGATATCACGCCTTGTGTA TTTTTG-3′

IFNAR2-RNAi-2：5′-AATTCAAAAA TACACAAGGCGTGATATCGTA CTCGAG TACGATATCACGCCTTGTGTA-3′

2)大量提取重组质粒GV248-IFNAR2，与辅助质粒pHelper1.0、pHelper2.0混合后通过脂质体(Lipofectamine2000)转染293T细胞，收集培养48h的细胞上清液，经离心，上清液过滤后得到慢病毒载体LV-IFNAR2-RNAi。