[发明专利]口服重组幽门螺杆菌疫苗的纯化工艺

权利要求书

1.一种口服重组幽门螺杆菌疫苗的纯化工艺，其特征在于：用发酵方式高密度表达LTB-UreB后，采用高压破菌、洗涤、裂解、阴离子交换柱层析、超滤、凝胶过滤层析技术，获得高纯度的LTB-UreB疫苗蛋白。

2.根据权利要求1所述的口服重组幽门螺杆菌疫苗的纯化工艺，其特征在于：具体操作步骤如下：

（1） 高压破菌：将高效表达LTB-UreB融合蛋白的大肠杆菌菌体用三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl）缓冲液悬浮，充分混合均匀后，采用高压均质机破菌，高速离心后收集沉淀，即包涵体；

（2） 洗涤：将步骤（1）所得包涵体采用洗涤液Ⅰ（10mmol/L Tris-HCl、1% Tween 80、pH 6.0～9.0）、洗涤液Ⅱ（10mmol/L Tris-HCl、2～3mol/L Urea、pH 6.0～9.0）进行洗涤，高速离心，收集沉淀；

（3） 裂解：将步骤（2）获得的沉淀利用裂解液（50mmol/L Tris-HCl、6～8mol/L Urea，pH 6.0～9.0）变性裂解过夜；

（4） 阴离子交换柱纯化：选择Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析（简称Q FF层析）进行初步纯化，使用平衡液（50mmol/L Tris-HCl、6～8mol/L Urea，pH 6.0～9.0）进行Q-FF层析柱平衡，利用含有不同浓度NaCl（30～55mmol/L）的平衡液进行梯度洗脱；

（5） 超滤：将步骤（4）所获得的蛋白样品使用超滤膜包进行浓缩；

（6） 凝胶过滤层析纯化：将上述所得的蛋白样品采用Sepherdex G-50凝胶过滤层析（简称G-50层析）进行纯化，利用NaHCO₃缓冲液进行平衡和洗脱。

3.根据权利要求2中所述的口服重组幽门螺杆菌疫苗的纯化工艺，其特征在于：所述步骤（1）使用600～800bar高压破菌技术，破菌率≥99%，高速离心获得包涵体。

4.根据权利要求2中所述的口服重组幽门螺杆菌疫苗的纯化工艺，其特征在于：所述步骤（2）所述采用洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ洗涤包涵体二次。

5.根据权利要求2中所述的口服重组幽门螺杆菌疫苗的纯化工艺，其特征在于：所述步骤（3）采用pH 6.0～9.0的裂解液进行变性裂解，于10～18℃搅拌过夜。

6.根据权利要求2中所述的口服重组幽门螺杆菌疫苗的纯化工艺，其特征在于：步骤（4）所述阴离子交换层析使用的填料为Q Sepharose Fast Flow，采用Q-FF层析进行目的蛋白LTB-UreB的纯化。

7.根据权利要求2中所述的口服重组幽门螺杆菌疫苗的纯化工艺，其特征在于：步骤（5）纯化的目的蛋白超滤浓缩至蛋白浓度为3～4 mg/mL。

8.根据权利要求2中所述的口服重组幽门螺杆菌疫苗的纯化工艺，其特征在于步骤（6）采用G-50层析进行脱盐和除尿素，使得蛋白质复性。