[发明专利]口服重组幽门螺杆菌疫苗的纯化工艺

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，尤其涉及一种口服重组幽门螺杆菌疫苗的纯化工艺。

技术背景

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是一种革兰氏阴性、微需氧的细菌，与慢性胃炎、消化性溃疡和胃腺癌密切相关。H.pylori感染是最常见的慢性感染病之一，已造成全世界50%以上的人口感染，在中国，H.pylori感染者已超过6亿。H.pylori的毒素和有毒物质不仅能破坏胃粘膜，还能使机体产生炎症和免疫反应，影响胃酸的分泌，最终导致一系列疾病的形成。

1994年世界卫生组织已将H.pylori列为I类致癌因子（grade carinogen）。现阶段临床上主要采用抑酸剂和二种或三种抗生素治疗H.pylori感染，但存在明显不足，包括疗效不稳定、易复发、易产生耐药性、毒副反应大和医疗费用高，最大的缺陷是不能根除H.pylori。如果能够成功地研制出一种既有预防功能又有治疗作用的疫苗，将成为防止H.pylori感染的高效生物制剂，并具有十分重大的社会意义和经济效益。

由于H.pylori疫苗蕴藏着巨大的社会效益和经济效益，早在二十世纪80年代就有H.pylori疫苗的研究。现有疫苗主要由以下五种形式：（1）全菌活疫苗，是较为传统的疫苗，其抗原成分复杂，含有H.pylori的所有抗原成分，免疫应答效率高，但是其特异性不高、易发生交叉免疫反应，具有致癌的潜在可能性，因此，众多研究者不鼓励发展H.pylori全菌疫苗；（2）亚单位疫苗，是H.pylori疫苗研究的重点，其抗原成分清楚、安全性好、特异性强，常见的亚单位疫苗的抗原主要包括尿素酶（UreA、UreB）、空泡毒素（VacA）、毒素相关蛋白（CagA）、粘附素（BabA、HpaA）等。据统计，选择尿素酶作为疫苗抗原的研究报道占H.pylori疫苗研究文献的70%以上，因此尿素酶已成为H.pylori疫苗首选亚单位抗原；（3）联合疫苗，具有两种或多种抗原成分。单价疫苗存在免疫原性弱、免疫效果差等缺点，而联合疫苗可获得比单价疫苗较好的免疫保护效果，能明显提高动物的免疫保护率；（4）核酸疫苗，属于第三代疫苗。与常规疫苗相比具有生产制备简便、高效、廉价、无致病性、能激发细胞和体液免疫应答等优点；（5）表位疫苗，是疫苗发展的新方向。表位疫苗是采用抗原表位制备而成的疫苗。表位疫苗具有特异性高、免疫原性强等特点，是H.pylori疫苗设计的新思路，具有较好的应用前景（杨武晨，郭红. 幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的疫苗研究进展. 中国人兽共患病学报[J]，2011，27（12）:1139-1142）。

现有的H.pylori疫苗免疫预防或治疗效果均不理想，其可能的原因是：（1）疫苗抗原的选择与组成不合理；（2）免疫佐剂活性不足，存在安全隐患；（3）免疫投递途径与方式不确定，使得免疫应答强度较弱（吴超，李海波等. 一种幽门螺杆菌多表位融合蛋白及其制备的多表位疫苗. 中国，201210330695.0，212.12.26）。由于H.pylori疫苗项目难度较大，绝大部分还集中在小鼠及灵长类动物身上试验，迄今为止，仅有几家研究单位分别进行了疫苗的I或II期临床试验。1999年由Orovax公司研发的重组H.pylori尿素酶治疗性疫苗进入II期临床试验，虽然有较好的保守性抗原和耐受性，但是需佐剂，且需多剂服用；Oravax公司研究的表达尿素酶的监督沙门菌进入I期临床试验，其服用简单，未产生明确的粘膜免疫反应；Antex Biologics公司研制的灭活全菌抗原疫苗进入II期临床试验，具有较全的免疫性，但制备困难，安全性需进一步考察（邹全明. 幽门螺杆菌疫苗的研究进展. 胃肠病学[J]，2007，12（9）:567-570）。因此，研制出一种用于H.pylori疫苗免疫预防的药物就显得尤为重要了。

发明内容

本发明的目的是提供一种口服重组幽门螺杆菌疫苗的纯化方法。该方法将裂解的包涵体蛋白在阴离子交换层析柱中进行NaCl浓度的梯度洗脱。本发明的优点是：该方法简捷、省时、纯度高，易于工业化生产，适用于口服重组幽门螺杆菌疫苗的制备，所获目的蛋白纯度经高效液相色谱（HPLC）检测，纯度可达到98%以上，应用在工业生产中将具有良好的经济效益。