[发明专利]用于免疫分析的免疫抑制剂药物提取试剂

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂领域，特别地，涉及改进的免疫抑制剂药物提取试剂，以及使用该提取试剂的提取方法和免疫检测试剂盒，可用于测定患者血液样品中免疫抑制剂的浓度水平。

背景技术

免疫抑制剂(Immunosuppressant)是一类通过抑制细胞及体液免疫反应而减轻组织损伤的化学或生物物质，广泛应用于器官移植后的抗排斥反应和治疗自身免疫性疾病(如：类风湿、红斑狼疮、强直性脊柱炎和自身免疫性溶血贫血等)。

目前常用的免疫抑制剂主要分为微生物代谢产物、糖皮质激素、抗代谢物、抗淋巴细胞抗体、烷化剂等五类，其中他克莫司(Tacrolimus，FK506)、环孢菌素(Cyclosporin A，CsA)、雷帕霉素(Rapamycin，RPM)等微生物代谢产物应用最广，它们主要通过抑制胞浆内神经钙蛋白的活性,阻断IL2等一系列细胞因子的转录，从而发挥其免疫抑制作用，有效抑制T淋巴细胞的活化与增殖。

对于移植患者的临床用药，免疫抑制剂的血液浓度过低则容易导致免疫排斥，而免疫抑制剂的血液浓度过高，则可能对肝、肾等器官产生毒性，并引发感染、肿瘤等一系列不良临床事件，因此，移植患者免疫抑制剂的合理用药要求精确检测其血液浓度。对于他克莫司、西罗莫司、环孢菌素A等常用免疫抑制剂,虽然它们结构各不相同，但在血液中均主要以蛋白结合物方式存在于红细胞中，要准确检测这些免疫抑制剂的血药浓度，必须使免疫抑制剂从其结合蛋白上解离下来，这是这类免疫抑制剂血药浓度检测的共同要求。

目前测定免疫抑制剂血药浓度的方法主要有受体结合法、HPLC-质谱联用(HPLC-MS)、微粒子酶免疫测定(MEIA)、化学发光微粒子免疫测定(CMIA)以及酶联免疫吸附法(ELISA)等。其中受体结合法主要用于药物研究；HPLC-MS法测定血药浓度准确、灵敏，但其操作繁琐，检测时间长，检测成本高，需要昂贵设备，主要用于科研领域或作为一种参考方法。MEIA和CMIA是目前常用的检测方法，其检测自动化程度高，检测结果准确。然而，上述方法在检测过程中均需使用甲醇、乙腈、乙醚等有机溶剂作为样品提取试剂，以溶解细胞和提取药物，该提取步骤不仅给实验操作和实验后处理带来不便，而且会不同程度地降低免疫检测的灵敏度和准确性，因为进入免疫反应体系的有机溶剂会不可避免地抑制抗体-药物之间的免疫结合反应，降低抗体的结合力，进而降低检测敏感度；另外，提取试剂中有机溶剂的挥发也容易引起药物浓度的波动，影响检测结果的准确性。

为降低有机溶剂对抗体结合FK506的抑制作用，Robert W.Siegel等人(Clinical Chemistry，2008,54:6,1008-1017；Pat.No.:US 8022188 B2)通过基因诱变方式对抗体的互补决定区加以改造，使检测灵敏度得到改善；但该方法需要核酸提取、扩增、测序、基因诱变、克隆筛选等复杂步骤，实用性不强。为了降低有机溶剂挥发引起的药物浓度波动，Frank C.Grenier等人采用低挥发性的DMSO配制血液药物提取试剂(US 2008/0020401 A1)，但该方法中所用的DMSO仍会严重抑制免疫检测体系中的抗体-药物间的结合反应，从而降低检测灵敏度；另外，同上述所有有机溶剂提取试剂一样，提取试剂的溶胞作用依赖高浓度的二价金属离子(10mM-100mM),且二价金属离子浓度的变化会导致提取效果的改变，因此全血样品中常用络合物抗凝剂(如：EDTA)的浓度变化可能引起提取试剂中二价金属离子的浓度变化，进而导致不同样品药物提取效果的差异，造成测量误差。

上述提取试剂处理后的样品均为非均质溶液，使用前需要离心去除固体杂质；该步骤也增加了操作的难度，延长了检测时间。

为避免有机溶剂对免疫检测的影响，Legay等人提出了以RAPA作为FK506的置换试剂的FK506检测方法(US Pat.6187547B1)；由于FK506和RAPA在血液中均主要与FKBP(FK结合蛋白)结合，少量与血清白蛋白和脂蛋白结合，且高度脂溶性的FK506和RAPA均可以快速穿透细胞膜，因此，免疫分析体系中高浓度的RAPA可以快速、有效地将血液中的FK506置换出来，且无需溶胞和蛋白变性；由于抗FK506抗体的高度特异性，高浓度的RAPA不干扰FK506的免疫检测；由于无需药物提取，该方法检测FK506更简单、快捷，可以准确检测大部分不含干扰因子的样品，但对于某些强干扰样品，尤其是使用了抗体类免疫抑制剂的患者样品，即使使用了相应的抗干扰措施，以该方法检测FK506仍常出现很大的误差。