[发明专利]测定血管性血友病因子活性的方法及检测试剂盒

说明书

本发明是申请日2008年7月3日、发明名称为“在不存在瑞斯托霉素的情况下测定血管性血友病因子活性的方法和测定ADAMTS-13蛋白酶的方法”、申请号为200880023579.6的申请的分案申请。

技术领域

本发明属于凝血诊断技术领域，涉及一种在样本中测定血管性血友病因子(VWF)活性的体外方法。所述方法包括对GPIbα蛋白功能获得性变异体的使用，这样就可不使用瑞斯托霉素、美洲矛头腹毒蛋白或与瑞斯托霉素或美洲矛头腹毒蛋白等效的其他物质。本发明还涉及一种测定血管性血友病因子(VWF)裂解ADAMTS-13蛋白酶活性的方法。

背景技术

血管性血友病因子(VWF)是血浆中的一种大分子多聚体糖蛋白，在初期止血过程中具有重要作用。另外，VWF具有胶原蛋白结合位点和用于定位于血小板表面的糖蛋白Ib(GPIb)的结合位点。GPIb是一种整合膜蛋白，会与另一种整合膜蛋白(糖蛋白IX(GPIX))在血小板膜中形成糖蛋白Ib-IX受体复合物。GPIb是双链分子，由一条表观分子质量约为145kDa的重链(同义词：heavy chain、α链或GPIbα)和一条表观分子质量约为22kDa的轻链(同义词：light chain、β链或GPIbβ)构成，这两条链通过二硫键彼此相连[Lopez,J.A.等人(1987)Cloning of theαchain of human platelet glycoprotein Ib:A transmembrane protein with homology to leucine-richα₂-glycoprotein.Proc.Natl.Acad.Sci USA 84:5615-5619]。

血管受伤时，VWF结合到暴露的胶原蛋白表面。由于与胶原蛋白结合以及受到增大的剪力(作用在与胶原蛋白结合的VWF上)的影响，VWF发生变化或被激活，从而可以结合到血小板膜的GPIb-IX受体复合物中的GPIb重链(GPIbα)的氨基末端。经激活的VWF通过这种方式俘获从旁边经过的血小板，使得受伤处形成由VWF、胶原蛋白和血小板构成的第一团聚体。随后血小板被激活，从而开始血浆凝血过程，该过程在经过复数次放大级联反应和血小板进一步聚集后最终促成伤口的愈合。

VWF在质或量上的异常是血管性血友病(同义词：von Willebrand Disease，VWD)的起因，这种病是最常见的遗传出血性疾病之一。就血管性血友病的诊断而言目前存在不同的筛查方法，例如测定出血时间(BT)、测定VWF抗原浓度(VWF:Ag)的定量法(例如ELISA方法)和测定VWF活性的方法(例如瑞斯托霉素诱导血小板凝集(VWF:RCo))。

瑞斯托霉素诱导固定血小板聚集的方法(又称“瑞斯托霉素辅因子检测”)还能识别VWF蛋白用测定VWF抗原浓度的定量法所识别不到的功能性缺陷。因此，为能对血管性血友病做出完全诊断，有必要实施用于测定瑞斯托霉素辅因子活性的瑞斯托霉素辅因子检测。实施瑞斯托霉素辅因子检测时通常是将患者的血浆样本与固定的血小板混合和与瑞斯托霉素混合。在斯托霉素的诱导下，样本所含的VWF结合到所添加的血小板的GPIb受体上，从而实现血小板的聚集。这一聚集反应的反应程度与患者样本所含的被激活的VWF的量有关。例如，这种聚集反应可通过测量传播增长进行光学检测，从而实现VWF:RCo活性的量化。

与VWF抗原检测相比，瑞斯托霉素辅因子检测的优点在于可对VWF进行活性测定，从而实现对VWF功能性紊乱的识别，以及对血管性血友病的不同子类进行分类，这些子类中仅部分子类也是随VWF抗原浓度的降低而出现。一般情况下，对这些子类进行分类时须形成VWF瑞斯托霉素辅因子活性(VWF:RCo)与VWF抗原浓度(VWF:Ag)的比率(Ratio)。对于血管性血友病的子类2A、2B和2M而言，VWF:RCo/VWF:Ag之比通常小于1。通常建议将0.7的比率作为极限值。

传统的瑞斯托霉素辅因子检测的不足之处在于实施过程很难自动化，因为在测量过程中需要不断地充分搅拌检测标本(Testansatz)中的血小板。此外，这种检测的精确度相对较低，对相关标准所规定的处于0％至20％范围内的低VWF活性的测定无法充分发挥作用。