[发明专利]一种红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体及其应用

权利要求书

1.一种红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体，其特征在于，由下述方法制备得到：

（1）通过RT-PCR方法克隆红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白基因的DNA，然后重组到谷胱甘肽S-转移酶融合基因表达载体pGEX-5x-1中，构建成pGEX-5x-1-CP重组质粒，所述pGEX-5x-1-CP重组质粒中含有谷胱甘肽S-转移酶和神经坏死病毒衣壳蛋白的融合基因；所述pGEX-5x-1-CP重组质粒的构建方法为：将DNA和pGEX-5x-1载体分别进行双酶切，再进行连接反应得到含有谷胱甘肽S-转移酶和神经坏死病毒衣壳蛋白的融合基因的pGEX-5x-1-CP重组质粒；

（2）重组质粒pGEX-5x-1-CP在大肠杆菌中的表达：将pGEX-5x-1-CP重组质粒转化大肠杆菌，次日挑选转化平板上的大肠杆菌单菌落于含有氨苄青霉素的培养基中扩大培养，利用IPTG诱导谷胱甘肽S-转移酶和神经坏死病毒衣壳蛋白的融合基因在大肠杆菌中表达；收集菌体，采用包涵体提纯技术提取并纯化得到GST-CP重组蛋白；所述GST-CP重组蛋白的分子量大小为66kDa~68kDa；

（3）用GST-CP重组蛋白免疫产蛋母鸡，收集免疫母鸡所产鸡蛋，从所收集的鸡蛋中提取并纯化卵黄抗体；所述免疫为两翅及两侧胸肌注射；所述免疫的次数为3次，每次免疫的时间间隔为2周；所述免疫方式为：首次免疫注射由GST-CP重组蛋白与等体积完全弗氏佐剂乳化成的疫苗，第二次及第三次免疫注射由GST-CP重组蛋白与不完全弗氏佐剂乳化成的疫苗。

2.根据权利要求1所述的红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体，其特征在于，所述RT-PCR方法为：以红鳍东方鲀神经坏死病毒为模板，将红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白基因反转录成第一链cDNA，再用特异性引物扩增得到双链DNA。

3.根据权利要求1所述的红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体，其特征在于，所述重组质粒pGEX-5x-1-CP在大肠杆菌中的表达为：pGEX-5x-1-CP重组质粒转化大肠杆菌，次日挑选转化平板上的单菌落于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200转/分钟进行恒温摇床培养，当大肠杆菌的OD值达到0.4~0.6 时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，在25~37℃诱导4~8小时。

4.根据权利要求1所述的红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体，其特征在于，步骤（3）所述从鸡蛋中提取并纯化卵黄抗体的方法为：将所收集鸡蛋的蛋清和蛋黄分离，取蛋黄，去掉卵黄膜，然后加入灭菌蒸馏水，充分摇匀、置于4℃条件下过夜后，收集上清即为卵黄抗体。

5.权利要求1~4任一所述红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体在制备鱼用抗神经坏死病毒疫苗制品中的应用。