[发明专利]一种红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体及其应用。所述卵黄抗体由下述方法制备：将红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白基因重组到GST融合基因表达载体pGEX‑5x‑1中，构建成pGEX‑5x‑1‑CP重组质粒；将pGEX‑5x‑1‑CP重组质粒转化大肠杆菌并诱导融合基因表达；采用包涵体提纯技术提取并纯化得到GST‑CP重组蛋白；用GST‑CP重组蛋白免疫母鸡，收集鸡蛋并从鸡蛋中提取卵黄抗体。本发明所制备的卵黄抗体能够有效抑制红鳍东方鲀神经坏死病毒，效价高，具有良好的免疫保护效力，可以在鱼类的稚鱼期，将其作为抗神经坏死病毒疫苗添加到鱼类饲料中。

发明领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体及其应用。

技术背景

神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)是一种在世界范围内流行的鱼类病原，流行在中国大陆、台湾、日本、澳大利亚、英国、加拿大、挪威等国家和地区，可造成30多种重要经济鱼类的稚鱼、仔鱼甚至石斑鱼成鱼大规模死亡，严重危害着鱼类的健康养殖。此病毒病的研究是国际水产病害的研究热点。神经坏死病毒分类上属于野田村病毒科(Nodaviridae)，乙型野田村病毒属(Betanodavirus)。病毒粒子直径约30-40纳米，二十面体，无囊膜。神经坏死病毒为单一正链、2节段RNA病毒。病毒基因组由RNA1和RNA2组成。RNA1编码病毒RNA聚合酶；RNA2编码衣壳蛋白，也是病毒的唯一结构蛋白，和病毒感染密切相关，是研究病毒疫苗的重要蛋白。神经坏死病毒主要感染鱼苗，患病鱼类在脑部和视网膜可见明显的空泡，可导致鱼苗死亡率达90％以上。目前对此病毒病还没有特效药物可以治疗，疫苗是防治此类疾病的重要手段。但是到目前为止，还没有商品化的疫苗。专利CN200410027186公开了一种神经坏死病毒重组蛋白疫苗，但是该疫苗存在以下不足：(1)神经坏死病毒感染鱼类是在稚鱼期，此时稚鱼还没有产生抗体的能力，因此此类疫苗无法在稚鱼期使用，因此应用价值不大；(2)这种疫苗需要靠注射来防疫，相对于人类和畜牧而言，由于鱼苗较小，生活在水中，注射免疫法耗时，操作不便，因而大大限制了该疫苗的商品化推广。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体及其应用。

为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体，由下述方法制备得到：

(1)通过RT-PCR方法克隆红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白基因的DNA，然后重组到谷胱甘肽S-转移酶融合基因表达载体pGEX-5x-1中，构建成pGEX-5x-1-CP重组质粒，所述pGEX-5x-1-CP重组质粒中含有谷胱甘肽S-转移酶和神经坏死病毒衣壳蛋白的融合基因；

(2)重组质粒pGEX-5x-1-CP在大肠杆菌中的表达：将pGEX-5x-1-CP重组质粒转化大肠杆菌，次日挑选转化平板上的大肠杆菌单菌落于含有氨苄青霉素的培养基中扩大培养，利用IPTG诱导谷胱甘肽S-转移酶(GST)和神经坏死病毒衣壳蛋白的融合基因在大肠杆菌中表达；收集菌体，采用包涵体提纯技术提取并纯化得到GST-CP重组蛋白；

(3)用GST-CP重组蛋白免疫产蛋母鸡，收集免疫母鸡所产鸡蛋，从所收集的鸡蛋中提取并纯化卵黄抗体。

按上述方案，所述GST-CP重组蛋白的分子量大小为66kDa～68kDa。

按上述方案，所述RT-PCR方法为：以红鳍东方鲀神经坏死病毒为模板，采用特异性引物将红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白基因反转录成第一链cDNA，再PCR扩增得到双链cDNA。

按上述方案，所述pGEX-5x-1-CP重组质粒的构建方法为：将cDNA和pGEX-5x-1载体分别进行双酶切，再进行连接反应得到含有谷胱甘肽S-转移酶和神经坏死病毒衣壳蛋白的融合基因的pGEX-5x-1-CP重组质粒。