[发明专利]确定中药中具有心肌保护和抗炎作用的活性成分的方法

说明书

技术领域

本发明涉及中药领域，特别涉及确定中药中具有心肌保护和抗炎作用的活性成分的方法。

背景技术

心血管疾病已经成为当今社会中致死率最高的疾病之一，并且发病率逐年增加。心血管疾病的种类很多，其中，发病率较高的一类是缺血性心脏病。这种缺血性心脏病包括粥样硬化病变引致的冠状动脉梗阻或狭窄。心肌缺血引致的左心室室壁瘤，心肌栓塞后心室间隔缺损和乳头肌缺血引起的二尖瓣关闭不全，是中老年常见多发的后天性心脏病。

研究表明，这种缺血性心脏病主要是由于长时间缺血导致心肌细胞缺氧引起心肌组织损伤和坏死，受损的心肌细胞炎性因子过度表达，其中白介素1β(1L-1β)可刺激细胞产生应激性氧分子，使心肌细胞膜通透性增加，产生脂质过氧化物使得三磷酸腺苷合成受阻，从而直接损害心脏的电生理功能和泵血功能，最终使心肌细胞变性，坏死。

中药对上述缺血性心脏病一般有较好的疗效，例如通脉养心丸等。这些治疗缺血性心脏病的中药都具有心肌保护和抗炎作用。但是，由于中药化学成分复杂，现在还不清楚各中药中具体哪些化学成分是具有心肌保护和抗炎作用的活性成分，无法测定这些活性成分的含量，这样不利于对中药进行质量控制，也影响中药的临床疗效。因此，如何能建立中药中具有心肌保护和抗炎作用的活性成分的确定方法，就显得格外重要。

发明内容

为解决上述问题，本发明实施例公开了确定中药中具有心肌保护和抗炎作用的活性成分的方法。

确定中药中具有心肌保护和抗炎作用的活性成分的方法，包括以下步骤：

(1)通过制备液相色谱获得目标中药各分离组分；

(2)通过心肌细胞抗氧化模型实验确定具有心肌保护作用的活性成分，所述心肌细胞抗氧化模型实验包括：

(A)将目标中药各分离组分针对目标心肌细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度；

(B)将目标心肌细胞分别用已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分进行保护，然后用指定氧化剂分别对已进行保护的目标心肌细胞进行损伤，并确定损伤后的目标心肌细胞的剩余数量，并根据所述剩余数量确定目标中药各分离组分对目标心肌细胞的相对保护率；

(C)将对目标心肌细胞相对保护率达到最低有效率的目标中药分离组分经LC-MS分析，确定出相对保护率达到最低有效率的各分离组分中所包含的化学成分；

用所确定的化学成分分别代替(B)部分的目标中药各分离组分，重复执行的(B)部分的操作，确定各化学成分的相对保护率，并将相对保护率达到最低有效率的化学成分确定为具有心肌保护作用的活性成分；

(3)通过巨噬细胞抗炎模型实验确定具有抗炎作用的活性成分，其中所述巨噬细胞抗炎模型实验包括：

(a)将目标中药各分离组分针对目标巨噬细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度；

(b)将目标巨噬细胞分组培养，每组的培养液中加入一种已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分及指定炎症诱导剂，培养结束后，确定各培养液上清液中的NO的含量，并根据所述NO的含量确定目标中药各分离组分对目标巨噬细胞的NO相对抑制率；

(c)将对目标巨噬细胞的NO相对抑制率达到抗炎有效率的目标中药分离组分经LC-MS分析，确定出NO相对抑制率达到抗炎有效率的各分离组分中所包含的化学成分；

用所确定的化学成分分别代替(b)部分的目标中药各分离组分，重复执行(b)部分的操作，将NO相对抑制率的半数抑制浓度在指定值以下的化学成分确定为具抗炎作用的活性成分。

其中，步骤(1)包括：获得目标中药的中药提取液，然后使所述中药提取液通过反相色谱柱；再对反相色谱柱进行洗脱，将洗脱液通过制备液相色谱进行分离，收集目标中药各分离组分。

其中，所述获得目标中药的中药提取液，包括：

将目标中药与甲醇水溶液混合后，进行提取、过滤，得到中药提取液；

所述反相色谱柱具体为：十八烷基硅烷键合硅胶为填料的中压反相色谱柱。

其中，所述(A)将目标中药各分离组分针对目标心肌细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度，具体为：