[发明专利]一种检测uPA功能的FRET生物传感器及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种检测uPA功能的FRET生物传感器，其特征在于，所述FRET生物传感器含有配体uPA特异底物的蛋白与荧光供体和荧光受体蛋白构建的融合蛋白的真核表达载体。

2.根据权利要求1所述的检测uPA功能的FRET生物传感器，其特征在于，所述FRET生物传感器还含有pcDNA3.1阳性质粒基因序列。

3.根据权利要求1或2所述的检测uPA功能的FRET生物传感器，其特征在于，所述配体uPA特异底物的蛋白由SED ID NO：1所示的氨基酸序列组成。

4.根据权利要求1或2所述的检测uPA功能的FRET生物传感器，其特征在于，编码所述配体uPA特异底物的蛋白的碱基序列如SED ID NO：2所示。

5.根据权利要求1～4之一所述的检测uPA功能的FRET生物传感器，其特征在于，所述荧光供体为ECFP；荧光受体为EYFP。

6.一种如权利要求1～5之一所述的检测uPA功能的FRET生物传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)荧光供体蛋白和荧光受体蛋白的基因克隆、鉴定：根据荧光供、受体蛋白质粒的相应地基因序列设计两对引物P1和P2，P3和P4，并在P1的5’端添加Hind III酶切位点，P2的5’端添加BamHI，P3的5’端添加BamHI和所述配体uPA特异底物的蛋白的碱基序列、Linker碱基序列；在P4的5’端添加EcoR I酶切位点，克隆含有上下游片段的荧光供、受体的基因全长序列；

(2)FRET生物传感器的构建：将pcDNA3.1(+)和荧光供体的PCR产物分别进行Hind III和BamH I双酶切处理，并将荧光供体的PCR产物插入pcDNA3.1(+)中，获得中间重组子pcDNA3.1(+)-荧光供体；接着用BamH I和EcoR I双酶切中间重组子pcDNA3.1(+)-荧光供体和荧光受体体的PCR产物，并将荧光受体的PCR扩增产物插入中间重组子pcDNA3.1(+)-荧光供体，获得重组质粒载体uPA生物传感器，并通过PCR、酶切、测序验证克隆目的片段的准确性。

7.根据权利要求6所述的检测uPA功能的FRET生物传感器的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述荧光供、受体蛋白质粒选自pECFP-C1、pEYFP-C1；相应地克隆ECFP的引物对P1和P2，如SED ID NO：3和如SED ID NO：4所示；相应地克隆EYFP的引物对P3和P4，如如SED ID NO：5和如SED ID NO：6所示。

8.根据权利要求1～5之一所述的检测uPA功能的FRET生物传感器在活细胞中检测uPA功能的应用。