[发明专利]一种检测uPA功能的FRET生物传感器及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种单分子型FRET生物传感器及其构建方法与应用，具体涉及一种活细胞中检测uPA功能的单分子型FRET生物传感器及其构建方法与应用。

背景技术

骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)作为一种慢性退行性疾病，多见于中老年人，其致痛、致残率高，严重影响老年人的生活质量。流行病学调查显示，国内外60岁以上的老年人OA患病率高达50％，且随着年龄的增加患病率呈显著上升趋势。研究表明，OA的发生与年龄、性别、免疫反应、骨内压升高、酶对软骨的降解、细胞因子等因素相关，另外与基因的多态性也有较大关系，但其具体的发病机制仍然不清。其中，由软骨细胞所产生的参与细胞外基质及基底膜成分降解的蛋白水解酶成为国内外学者研究OA发病机制的热点。最新的研究表明，在众多酶系中，基质金属蛋白酶系统中MMP-3和丝氨酸蛋白水解酶系统中uPA在软骨的退变中起着极其重要的作用。其中，尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)是一种丝氨酸蛋白水解酶，在软骨退变的过程中扮演着始动因子的角色，其通过激活大量MMP-3，共同参与软骨细胞外基质的降解。基质金属蛋白酶-3(MMP-3)即基质溶解素-1，是基质金属蛋白酶类的主要成员之一，在正常稳定状态组织中MMP-3表达量很少，而在炎性细胞因子、激素、生长因子刺激下和细胞转化过程中其表达量上升，MMP-3可以通过降低激活纤溶酶原而下调与细胞有关的纤溶酶活性，同时也可以水解抗纤溶酶(a-AP)，从而促进纤溶酶介导的蛋白酶解，由此可见MMP-3和uPA共同促进软骨的降解。因此，研究uPA和MMPs之间的相互作用非常重要，然而近几年发展起来的生物技术均以细胞的破碎为代价，无法在活细胞状态下研究蛋白质及分子之间的相互作用，应用荧光共振能量转移技术(FRET)并结合基因工程等技术正好弥补了这一缺陷。

目前，FRET是一种观察活细胞内分子之间相互作用等的新技术，作为1～10nm距离范围内的光学“分子尺”，具有高分辨率、高灵敏度、简单方便的优点，可以定时、定量、定位、无损伤的检测活细胞内蛋白质相互作用以及蛋白酶活性等；其基本原理是通过易于检测的荧光共振能量转移的效率信息来反映两分子团的距离信息，而距离接近到10nm之间是两分子相互作用或一分子的两个结构域因构象改变而相互靠近的有力证据。通过FRET效率的增强可检测分子间发生相互作用或构象改变而靠近；FRET效率的减弱可用于证明两分子远离因而失去相互作用，或证明一个分子的两个部分间因分子被切断或构象改变而相互远离。FRET主要可分为分子内FRET和分子间FRET，即单分子型FRET和双分子型FRET：前者指在一个分子上标记两个探针，检测这个分子自身发生的一些变化；后者指在不同的两个分子上分别标记供体和受体探针，检测这两个分子之间的相互作用，受几方面的影响，双分子型FRET不如单分子型FRET。因此，利用FRET原理将所要研究的目的蛋白和荧光蛋白连接在一起构建融合蛋白，令其在细胞中表达，在一定条件下就可以研究蛋白质、各种分子之间相互作用以及蛋白酶的活性了。但是在制作单分子型FRET生物传感器时，特有的能量转移有效距离使得在涉及能量转移体系时需要复杂的表面功能化、供受体荧光蛋白与目的蛋白之间的化学键和制备步骤，其中，接头序列(Linker)设计是基因融合技术能否成功的关键技术之一，即通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来，使其在适当的生物体内表达成为一条单一的肽链，其中起连接作用的氨基酸称为Linker。融合蛋白中的两种成分能否分别形成正确的空间结构、更好的发挥生物学活性，与连接融合蛋白中两种成分的接头序列密切相关。重组生成的融合蛋白要求插入融合蛋白中的linker不能影响目的蛋白各自的功能，因此，Linker序列的设计和选择对融合基因的构建至关重要。由上述众多因素导致开发高灵敏度的单分子型生物传感器受到了较大限制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种检测uPA功能的FRET生物传感器及其构建方法与应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，

本发明之一种检测uPA功能的FRET生物传感器，所述FRET生物传感器含有配体uPA特异底物的蛋白与荧光供体和荧光受体蛋白构建的融合蛋白的真核表达载体。

进一步，所述FRET生物传感器还含有pcDNA3.1(+)质粒基因序列。

进一步，所述配体uPA特异底物的蛋白由SED ID NO：1所示的氨基酸序列组成。