[发明专利]一种表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌及制备方法和应用有效
申请号: | 201510155501.1 | 申请日: | 2015-04-02 |
公开(公告)号: | CN104818227B | 公开(公告)日: | 2017-06-20 |
发明(设计)人: | 王菊芳;马毅;李杉;苏艳芳 | 申请(专利权)人: | 华南理工大学 |
主分类号: | C12N1/20 | 分类号: | C12N1/20;C12N15/70;C12N15/62;A61K35/744;A61P39/02;C02F3/34;B01D53/84;C12R1/19;C12R1/01;C02F101/20 |
代理公司: | 广州市华学知识产权代理有限公司44245 | 代理人: | 宫爱鹏 |
地址: | 510006 广东省*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 表面 锚定 金属 蛋白 食品级 乳酸 球菌 制备 方法 应用 | ||
1.一种表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)构建含锚定单元的人I型金属硫蛋白的重组融合表达载体:
通过重叠PCR将cA基因与hMT基因进行拼接,两基因之间引入linker,N端引入促表达标签,得到重组cA-hMT基因;cA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,hMT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,linker的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;
(2)将重组cA-hMT基因连接至表达载体pET21a,再将得到的连接产物pET21a-cA-hMT转化至大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性克隆,经过鉴定得到工程菌;
(3)将步骤(2)得到的工程菌诱导表达融合蛋白cA-hMT,收获菌体后超声破碎,将上清液直接与乳酸乳球菌室温孵育,融合蛋白cA-hMT则锚定到乳酸乳球菌表面。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)的重组表达还需加入分子伴侣,具体步骤如下:
将步骤(2)所述的连接产物pET21a-cA-hMT和含有分子伴侣的表达载体先后转化至大肠杆菌的表达菌株。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述分子伴侣为dnaK,dnaJ,grpE,groES和groEL中的一种或两种以上。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法,其特征在于,所述乳酸乳球菌还经如下预处理:将乳酸乳球菌湿菌体加醋酸处理并煮沸30min,PBS洗涤后再与重组融合蛋白cA-hMT进行锚定。
5.根据权利要求1或2或3所述的方法,其特征在于,步骤(3)工程菌诱导表达重组融合蛋白cA-hMT的步骤如下:
a.将工程菌接种于含氨苄青霉素和氯霉素的液体LB培养基,于37℃、180rpm振摇过夜,然后按1:100的比例接种于含有氨苄青霉素、氯霉素、L-阿拉伯糖的液体LB培养基中,当OD达0.4~0.8时加入终浓度为0.5~1.0mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG),于200rpm、低温继续培养12h后收集菌液,离心得到菌体;
b.用PBS缓冲液洗涤步骤a所得菌体2次,用细菌裂解液重悬,置于冰浴下超声破碎,取超声后的匀浆物离心,分别收集上清液和包涵体。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(3)将融合蛋白cA-hMT锚定到乳酸乳球菌表面的步骤如下:
将上清液直接与乳酸乳球菌重悬,室温静置1h,9000g离心2min弃上清,沉淀用PBS溶液洗涤3次,重悬至4℃保存。
7.根据权利要求1或2或3所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述乳酸乳球菌为MG1363、MG1614、LM0230。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述乳酸乳球菌的培养步骤如下:
将乳酸乳球菌在GM17液体培养基中培养,30℃厌氧静置培养至对数生长期晚期或平台期,OD600nm达3~4,室温9000g离心5min,收集湿菌体。
9.权利要求1~8任一项方法制得的表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌。
10.权利要求9所述表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌的应用,其特征在于,所述乳酸乳球菌用于人体重金属解毒、修复重金属氧化损伤、金属离子代谢调节以及废水废气处理和环境修复。
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