[发明专利]一种表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌及制备方法和应用有效

专利信息
申请号: 201510155501.1 申请日: 2015-04-02
公开(公告)号: CN104818227B 公开(公告)日: 2017-06-20
发明(设计)人: 王菊芳;马毅;李杉;苏艳芳 申请(专利权)人: 华南理工大学
主分类号: C12N1/20 分类号: C12N1/20;C12N15/70;C12N15/62;A61K35/744;A61P39/02;C02F3/34;B01D53/84;C12R1/19;C12R1/01;C02F101/20
代理公司: 广州市华学知识产权代理有限公司44245 代理人: 宫爱鹏
地址: 510006 广东省*** 国省代码: 广东;44
权利要求书: 查看更多 说明书: 查看更多
摘要:
搜索关键词: 一种 表面 锚定 金属 蛋白 食品级 乳酸 球菌 制备 方法 应用
【权利要求书】:

1.一种表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:

(1)构建含锚定单元的人I型金属硫蛋白的重组融合表达载体:

通过重叠PCR将cA基因与hMT基因进行拼接,两基因之间引入linker,N端引入促表达标签,得到重组cA-hMT基因;cA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,hMT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,linker的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;

(2)将重组cA-hMT基因连接至表达载体pET21a,再将得到的连接产物pET21a-cA-hMT转化至大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性克隆,经过鉴定得到工程菌;

(3)将步骤(2)得到的工程菌诱导表达融合蛋白cA-hMT,收获菌体后超声破碎,将上清液直接与乳酸乳球菌室温孵育,融合蛋白cA-hMT则锚定到乳酸乳球菌表面。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)的重组表达还需加入分子伴侣,具体步骤如下:

将步骤(2)所述的连接产物pET21a-cA-hMT和含有分子伴侣的表达载体先后转化至大肠杆菌的表达菌株。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述分子伴侣为dnaK,dnaJ,grpE,groES和groEL中的一种或两种以上。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法,其特征在于,所述乳酸乳球菌还经如下预处理:将乳酸乳球菌湿菌体加醋酸处理并煮沸30min,PBS洗涤后再与重组融合蛋白cA-hMT进行锚定。

5.根据权利要求1或2或3所述的方法,其特征在于,步骤(3)工程菌诱导表达重组融合蛋白cA-hMT的步骤如下:

a.将工程菌接种于含氨苄青霉素和氯霉素的液体LB培养基,于37℃、180rpm振摇过夜,然后按1:100的比例接种于含有氨苄青霉素、氯霉素、L-阿拉伯糖的液体LB培养基中,当OD达0.4~0.8时加入终浓度为0.5~1.0mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG),于200rpm、低温继续培养12h后收集菌液,离心得到菌体;

b.用PBS缓冲液洗涤步骤a所得菌体2次,用细菌裂解液重悬,置于冰浴下超声破碎,取超声后的匀浆物离心,分别收集上清液和包涵体。

6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(3)将融合蛋白cA-hMT锚定到乳酸乳球菌表面的步骤如下:

将上清液直接与乳酸乳球菌重悬,室温静置1h,9000g离心2min弃上清,沉淀用PBS溶液洗涤3次,重悬至4℃保存。

7.根据权利要求1或2或3所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述乳酸乳球菌为MG1363、MG1614、LM0230。

8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述乳酸乳球菌的培养步骤如下:

将乳酸乳球菌在GM17液体培养基中培养,30℃厌氧静置培养至对数生长期晚期或平台期,OD600nm达3~4,室温9000g离心5min,收集湿菌体。

9.权利要求1~8任一项方法制得的表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌。

10.权利要求9所述表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌的应用,其特征在于,所述乳酸乳球菌用于人体重金属解毒、修复重金属氧化损伤、金属离子代谢调节以及废水废气处理和环境修复。

下载完整专利技术内容需要扣除积分,VIP会员可以免费下载。

该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于华南理工大学,未经华南理工大学许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服

本文链接:http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201510155501.1/1.html,转载请声明来源钻瓜专利网。

×

专利文献下载

说明:

1、专利原文基于中国国家知识产权局专利说明书;

2、支持发明专利 、实用新型专利、外观设计专利(升级中);

3、专利数据每周两次同步更新,支持Adobe PDF格式;

4、内容包括专利技术的结构示意图流程工艺图技术构造图

5、已全新升级为极速版,下载速度显著提升!欢迎使用!

请您登陆后,进行下载,点击【登陆】 【注册】

关于我们 寻求报道 投稿须知 广告合作 版权声明 网站地图 友情链接 企业标识 联系我们

钻瓜专利网在线咨询

周一至周五 9:00-18:00

咨询在线客服咨询在线客服
tel code