[发明专利]一种表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域的基因重组表达技术领域，具体涉及一种表面锚定有人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌制备方法及应用。

背景技术

金属硫蛋白(Metallothionein,MT)具有非常保守的一级结构和相似的空间结构，广泛分布于动物、植物和微生物中，是一类富含半胱氨酸、低分子量(6000～7000道尔顿)、具有较强结合金属离子能力的蛋白质(Vasak M.Advances in metallothionein structure and functions.J Trace Elem Med Biol,2005,l19:13–17.)。MT具有结合重金属、清除自由基、抗辐射、抗衰老以及调节微量元素平衡等重要生理功能(Yang F et al.High-yield expression in Escherichia coli of soluble human MT2A with native functions.Protein Expr Purif,2007,53:186–194.)。目前，MT已成为医学、生物化学、分子生物学以及环境保护等科研领域的热门研究课题。同时由于MT高效的重金属解毒功能与安全性，已被广泛应用于医疗、化妆品、保健品及环保等生产领域。

利用重金属诱导动物可获得可溶性MT，但产量低且提纯步骤复杂繁琐，导致生产成本极高，限制了MT的应用。由于MT分子量小，半胱氨酸含量高，在原核体系中表达易形成包涵体，尚未见用大肠杆菌大量生产可溶性MT的报道(Butt TR et al.Ubiquitin fusion augments the yield of cloned gene products in Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:2540-2544)。目前，均采用GST、Sumo等促溶标签重组表达MT蛋白(Huang Y et al.Expression and purification of glutathione transferase-small ubiquitin-related modifier-metallothionein fusion protein and its neuronal and hepatic protection against D-Galactose-induced oxidative damage in mouse model,JPET,2009,329:469–478.)。

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一种人体内的益生菌，被广泛应用于奶制品生产，肉、蔬菜、面包的发酵等方面，因此被普遍认为是安全级微生物(Generally Recognized As Safe,GRAS；Gilliland SE.Health and nutritional benefits from lactic acid bacteria.FEMS MicrobiolRev.1990,7(1-2):175-188)。从20世纪80年代开始，人们就开始致力于对各种乳酸菌尤其是乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的生物学特性和分子机制进行研究。乳酸乳球菌作为表面展示外源蛋白的理想菌株有其独特的优势：首先，其自身分泌的蛋白质少，胞外蛋白酶的活性低，目的蛋白质的表达不会受到乳酸乳球菌自身蛋白质的影响；其次，抗原性弱，不会产生内毒素，进入人体不会引起强烈的免疫应答；最后，乳酸乳球菌不在胃肠道内定殖，可以避免因其长期定殖而导致的免疫耐受(冯金，乳酸乳球菌表面展示技术，生命的化学，2013,33(1):91-95)。因此乳酸乳球菌现已作为一种食品级表达宿主用于表达和表面展示各种抗原、生长因子以及功能蛋白(Ribeiro LA,et al.Production and targeting of the Bmedhabortus antigen L7/L12in Lactococcuslactis:a first step towards food-grade live vaccines against Brucellosis,Applied and Environmental Microbiology 2002,68(2):910-916)。但利用乳酸菌表达外源基因存在表达量低，重组乳酸菌会引入外源基因，使用抗生素作为筛选标记会引入抗性基因等一些不容忽视的问题。

发明内容