[发明专利]一种分离骨髓单个核细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离骨髓单个核细胞的方法。

背景技术

骨髓中单个核细胞包括造血干细胞(HSC)、骨髓间充质干细(MSCs)、内皮细胞(EPC)、和基质细胞等多种细胞的混合体。就目前而言，骨髓单个核细胞中的造血干细胞已用于移植术并大量运用于临床治疗各种血液疾病且取得了很好的疗效。近年来大量实验研究证明骨髓中也含有一定数量的骨髓间充质干细胞(BMSCs)，所述骨髓间充质干细胞是指一群可向成骨细胞、成脂细胞、骨髓基质细胞、肝脏细胞、神经细胞等多种细胞分化的多潜能组织干细胞，具有以下优点：(1)体外易获得、易分离培养，增殖快；(2)具有独特的免疫学特性：不表达MHC II类分子和共刺激分子B7-1、B7-2，故不能刺激机体产生免疫反应；将BMSCs输入体内之后不会被排斥，可以在宿主体内长期存活；(3)具有诱导免疫耐受的潜力；(4)易于基因操作，组织相容性好；(5)不受伦理学限制。因此，BMSCs成为近年来细胞治疗和细胞工程中的首选种子细胞，有着广阔的应用前景。其阳性表面标志为SH-2、CD44⁺、CD71⁺、CD90、和CD106，目前认为典型标记为CD44⁺、CD71⁺。目前用于分离骨髓间充质干细胞的方法有：贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪法和免疫磁珠法。由于流式细胞仪法对细胞损伤较大，免疫磁珠法价格相对较高，因此现实中多采用密度梯度离心法和贴壁筛选法结合使用，以提高所得BMSCS的纯度。

但目前对骨髓单个核细胞的分离方法报道还不多，国内外常用的方法为Ficoll一步法。由于应用此方法离心后部分红细胞仍悬浮于Ficoll溶液中致使收集的MNCs可能混杂红细胞，不利于MNCs收集。因而寻找一种更为简便高效的MNCs分离培养方法具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，设计研发一种新型分离骨髓单个核细胞的方法。所述方法利用明胶溶液可以破坏红细胞表面电荷而加速红细胞的沉积，对其他主成分包括单个核细胞无影响这一点以及骨髓中单个核细胞与其他成分存在密度差异，利用淋巴细胞分离液作密度梯度离心时各种细胞成分按密度梯度重新分布聚集，从而获得单个核细胞这一原理进行骨髓中单个核细胞的分离。利用本方法分离骨髓单个核细胞不会增加MNCs的损失，且能更好地保留骨髓造血干细胞和骨髓间充质干细胞，操作简单方便，可进行临床推广。

本发明提供一种分离骨髓单个核细胞的方法，包括如下步骤：

步骤1；取骨髓液与明胶混匀，自然沉降一段时间。

步骤2：取步骤1中得到的明胶悬液层进行离心分离操作，弃去上清液，加入PRMI1640培养液重悬细胞。

步骤3：取步骤2中得到的重悬细胞液与低糖DMEM培养液混匀，缓慢加入到Ficoll溶液表面，室温下进行离心分离操作。

步骤4：离心完毕后，小心吸取步骤3中得到的混悬液中层云雾状细胞层，用PBS洗涤后进行离心分离操作，以含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液配成一定浓度的悬液，即得。

进一步地说，所述步骤1中的明胶的质量百分比为3％，骨髓液与明胶的体积比为1∶1，沉降时间为1h。

进一步地说，所述步骤2中的离心分离操作参数为取350g明胶悬液层离心分离8min。

进一步地说，所述步骤3中的重悬细胞液与低糖DMEM培养液及Ficoll溶液的体积比为1∶1∶2，离心分离操作参数为取800g上述混悬液离心分离20min。

进一步地说，所述步骤4中的用PBS洗涤次数为2～3次，离心分离操作参数为取上述用PBS洗涤后的混悬液中层云雾状细胞层600g离心分离5min，配制悬液浓度为1×10⁶个/ml。

本发明的有益效果在于：利用本发明的方法分离骨髓单个核细胞不会增加MNCs的损失，且能更好地保留骨髓造血干细胞和骨髓间充质干细胞，操作简单方便，可进行临床推广。

具体实施方式

本发明提供一种分离骨髓单个核细胞的方法，包括如下步骤：

步骤1：取骨髓液与明胶混匀，自然沉降一段时间。

步骤2：取步骤1中得到的明胶悬液层进行离心分离操作，弃去上清液，加入PRMI1640培养液重悬细胞。

步骤3：取步骤2中得到的重悬细胞液与低糖DMEM培养液混匀，缓慢加入到Ficoll溶液表面，室温下进行离心分离操作。