[发明专利]军团菌毒力基因检测与分型方法

权利要求书

1.军团菌毒力基因检测与分型方法，其特征在于：应用细菌基因组DNA提取液提取待测样品中的细菌基因组DNA；以细菌基因组DNA为模板，用PCR上下游引物混合液进行PCR扩增，同时将阳性对照和阴性对照进行PCR扩增，将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；若出现条带，则说明标本中含有与PCR上下游引物对应的军团菌毒力基因；反之，则说明标本中不含与PCR上下游引物对应的军团菌毒力基因；其中，所述PCR上下游引物混合液为10对引物，具体为：

（1）iraA-F：5’-CCTGTAGCGCAACAACAACT-3’；

     iraA-R：5’-CCAGGTGCCCTCTATTCCAA-3’；

（2）iraB-F：5’-CGCATCCAGTATGGTTTCTC-3’；

     iraB-R：5’-AACGTTTCGCAAAATTCAAG-3’；

（3）lvrA-F：5’-CAAAGAACAACGCACAAGCA-3’；

     lvrA-R：5’-TCAAGCCAATTTGCTGGGT-3’；

（4）lvrB-F：5’-TAAAACGATGGAGCCAATC-3’；

     lvrB-R：5’-ACCTGCAATGATGATGCAAG-3’；

（5）lvhD-F：5’-CAAAATTCAACGCCTGACCG-3’；

     lvhD-R：5’-AGGCCAGCCAATCATCAAATC-3’；

（6）cpxR-F：5’-AAAATCCCAACTCCCAAAC-3’；

     cpxR-R：5’-CGATACTGCGGTCATAAGC-3’；

（7）cpxA-F：5’-ACAACCAGCTCGAGAGGA-3’；

     cpxA-R：5’-GCCATCACTTGGGAGTTC-3’；

（8）dotA-F：5’-TTGGTGCAGCCGATAAAAT-3’；

     dotA-R：5’-ACCCCACAAGGTGGACTCTT-3’；

（9）icmC-F：5’-ATGGAGAAGCCAGGACAA-3’；

     icmC-R：5’-ACCCGGATAATCATCACCA-3’；

（10）icmD-F：5’-GGCTAGTAAGCGCAGCTTG-3’；

      icmD-R：5’-CCCAATCCAGCCAAGTAAG-3’。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述军团菌毒力基因为：iraA，iraB，lvrA，lvrB，lvhD，cpxR，cpxA，dotA，icmC，icmD。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细菌基因组DNA提取液的配方为：Chelex 100 resin 5%；Tris-HCl 10 mM，pH8.3；乙二胺四乙酸二钠 0.1 mM；叠氮钠 0.1 %；蛋白酶K 200μg/ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增条件为：94℃ 3 min, 94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 20 s，35个循环，72℃ 5 min, 4℃ 贮存。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述阳性对照包含军团菌基因组DNA和特异引物，所述阴性对照包含特异引物；所述特异引物为：Leg386F: 5'-AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3'；Leg386R: 5'-CCAACAGCTAGTTGACATCG-3'。