[发明专利]军团菌毒力基因检测与分型方法

说明书

技术领域

本发明涉及军团菌毒力基因检测与分型方法。

背景技术

目前，已知军团菌有58种70多个血清型，主要分为两大类：一类是以嗜肺军团菌为主的对人类有明显致病性的军团菌种，该军团菌种有16个血清型；另一类是对人体没有明显致病性的军团菌种，被称为非嗜肺军团菌，其中有24种可引起人类致病。军团菌的致病性与其毒力基因密切相关，本发明建立了军团菌的10个毒力基因检测方法，能用于检测、鉴别军团菌10个毒力基因及其分布状况和对人体的致病性。

虽然临床上80%以上的军团菌感染是由嗜肺军团菌引起的，水环境中也广泛存在嗜肺军团菌；但是某些非嗜肺军团菌种也具有较为广泛的存在性和一定的感染力，目前已知至少有24个种的非嗜肺军团菌种与人类疾病相关。因此，建立一种能检测嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌毒力基因的方法是十分必要的。

发明内容

本发明针对目前军团菌种检测方法中存在着不能鉴别军团菌相对毒力大小的问题，提供了一种军团菌毒力基因检测与分型方法，不仅能检测临床和环境水标本中军团菌中的毒力基因，而且可以将军团菌种进一步分型检测其存在的毒力基因，鉴别各类军团菌种的相对致病性及其致病力的强弱，了解不同军团菌种毒力基因的分布状况及其对人体的相对致病性，对研究军团菌种的致病机理是一种不可或缺的工具。

本发明采用的技术方案为：

本发明公开了军团菌毒力基因检测与分型方法，应用细菌基因组DNA提取液提取待测样品中的细菌基因组DNA；以细菌基因组DNA为模板，用PCR上下游引物混合液进行PCR扩增，同时将阳性对照和阴性对照进行PCR扩增，将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；若出现条带，则说明标本中含有与PCR上下游引物对应的军团菌毒力基因；反之，则说明标本中不含与PCR上下游引物对应的军团菌毒力基因；其中，所述PCR上下游引物混合液为10对引物，具体为：

（1）iraA-F：5’-CCTGTAGCGCAACAACAACT-3’；

 iraA-R：5’-CCAGGTGCCCTCTATTCCAA-3’；

（2）iraB-F：5’-CGCATCCAGTATGGTTTCTC-3’；

 iraB-R：5’-AACGTTTCGCAAAATTCAAG-3’；

（3）lvrA-F：5’-CAAAGAACAACGCACAAGCT-3’；

 lvrA-R：5’-GCAAGCCAATTTGCTGGGT-3’；

（4）lvrB-F：5’-TAAAACGATGGAGCCAATC-3’；

     lvrB-R：5’-ACCTGCAATGATGATGCAAG-3’

（5）lvhD-F：5’-CAAAATTCAACGCCTGACCG-3’；

 lvhD-R：5’-AGGCCAGCCAATCATCAAATC-3’；

（6）cpxR-F：5’-AAAATCCCAACTCCCAAAC-3’；

 cpxR-R：5’-CGATACTGCGGTCATAAGC-3’；

（7）cpxA-F：5’-ACAACCAGCTCGAGAGGA-3’；

 cpxA-R：5’-GCCATCACTTGGGAGTTC-3’；

（8）dotA-F：5’-TTGGTGCAGCCGATAAAAT-3’；

 dotA-R：5’-ACCCCACAAGGTGGACTCTT-3’；

（9）icmC-F：5’-ATGGAGAAGCCAGGACAA-3’；

icmC-R：5’-ACCCGGATAATCATCACCA-3’；

（10）icmD-F：5’-GGCTAGTAAGCGCAGCTTG-3’；

icmD-R：5’-CCCAATCCAGCCAAGTAAG-3’。

优选地，所述军团菌毒力基因为：iraA，iraB，lrvA，lvrB，lvhD，cpxR，cpxA，dotA，icmC，icmD。

优选地，所述细菌基因组DNA提取液的配方为：Chelex 100 resin 5%；Tris-HCl 10 mM，pH8.3；乙二胺四乙酸二钠 0.1 mM；叠氮钠 0.1 %；蛋白酶K 200 g/ml。