[发明专利]一种高效发酵生产L-丙氨酸的大肠杆菌

说明书

本发明公开了一种高效发酵生产L‑丙氨酸的大肠杆菌，属于微生物代谢工程技术领域。本发明提供的大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC No.10628的染色体上副产物乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸合成途径编码基因ackA‑pta、pflB、adhE、frdA、ldhA被删除，且其染色体dadX基因被替换为丙氨酸脱氢酶基因。利用该重组菌在28～45℃条件下发酵26h，产生106g/L或以上具有高光学纯度和高化学纯度的L‑丙氨酸，整个发酵过程生产强度达到4.27g/L·h或以上。

技术领域

本发明涉及一种高效发酵生产L-丙氨酸的大肠杆菌，属于微生物代谢工程技术领域。

背景技术

L-丙氨酸是最小的手性分子之一，被用于医药和兽药行业，与其他L-型氨基酸共同用作手术前和手术后的营养剂。由于L-丙氨酸具有甜味，也被用于食品添加剂。此外，丙氨酸也可用于合成改性耐热塑料，例如(PA)s、poly(ester-amide)s(PEA)s、poly(ester-amide-sulfide)s(PEAS)s以及poly(ester-imide)s(PEI)s等。然而L-丙氨酸生产成本高，使其应用受到限制。

近年来，利用基因工程手段，将外源丙氨酸脱氢酶基因引入E.coli菌株，在E.coli中实现了L-丙氨酸的合成(Lee M.et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2004,65:56-60；Smith G.M.et al.,Biotechnol Lett,2006,28:1695-1700；Zhang X.et al.,ApplMicrobiol Biotechnol,2007,77:355-366)。Smith等(Smith G.M.et al.,BiotechnolLett,2006,28:1695-1700)将来源于Bacillus sphaericus的alaD基因克隆于质粒载体上，并在E.coli ALS929(pfl pps poxB ldhA aceEF)菌株中表达，可利用复杂培养基合成88g/L丙氨酸，丙氨酸合成阶段体积生产强度达到4g/L·h。Zhang等(Zhang X.et al.,ApplMicrobiol Biotechnol,2007,77:355-366)将来源于Geobacillus stearothermophilus的alaD基因整合于重组E.coli SZ194染色体上，经驯化后，最终菌株XZ132(pflB frd adhEackA mgsA dadX ldhA::alaD)经48h发酵，可利用无机盐培养基以及120g/L葡萄糖合成1279mmol丙氨酸，整个发酵过程中丙氨酸生产强度为2.37g/L·h，丙氨酸转化率达到95g/100g葡萄糖，L-丙氨酸光学纯度达到99.5％，是目前利用重组E.coli菌株进行L-丙氨酸合成的最高产量。

本发明以野生型E.coli B100为出发菌株，构建出高效合成L-丙氨酸的新型E.coli重组菌株。通过控制温度，在菌体生长阶段关闭重组菌株L-丙氨酸的合成，避免产物对菌体生长的抑制和竞争作用；在L-丙氨酸合成阶段，高效开启L-丙氨酸合成途径，以葡萄糖为唯一碳源进行L-丙氨酸的高水平合成，不需要添加一些昂贵的化合物进行诱导，不需用惰性气体控制严格的厌氧环境，具有更好的应用前景。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种能以廉价原料和粗放发酵条件，高效生产高光学纯度和高化学纯度L-丙氨酸的大肠杆菌62ALA。

所述菌株分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，已于2015年3月16日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.10628。

所述菌株的染色体上副产物乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸的合成途径编码基因ackA-pta、pflB、adhE、frdA、ldhA被敲除。