[发明专利]构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除系统的穿梭载体

权利要求书

1.构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除系统的穿梭载体，该穿梭载体携带有痘苗病毒胸腺激酶的侧翼序列TKR与TKL，能插入外源目标病毒基因的多克隆位点MCS，以及启动插入的外源基因高效表达痘苗病毒早晚启动子P7.5，其特征在于，其还携带有两端带有同源序列的自删除标记基因系统。

2.根据权利要求1所述的穿梭载体，其特征在于，所述自删除标记基因系统包括标记基因启动子：痘苗病毒启动子p11，标记基因EGFP，以及两者外侧的同源序列。

3.根据权利要求2所述的穿梭载体，其特征在于，该穿梭载体还携带有抗性筛选标记基因。

4.根据权利要求3所述的穿梭载体，其特征在于，该抗性筛选标记基因为用于穿梭质粒载体在大肠杆菌中的氨苄抗性筛选。

5.根据权利要求4所述的穿梭载体，其特征在于，其序列为SEQID No.1。

6.一种构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除系统的穿梭载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：设计引物P-EGFP-1：5’-CCGCTCGAGGATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’和P-EGFP-2：5’-CCCATCGATTTATTATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’，并以pEGFP-C3质粒上的EGFP基因为模板进行PCR，得到两端携带有XhoI和ClaI两个限制性内切酶的酶切位点的EGFP基因；

步骤二：将pSC11质粒与步骤一PCR产物同时进行XhoI和ClaI双酶切；酶切产物回收后以T4DNA连接酶连接；将连接后的产物转化到感受态细胞DH5α；并进行PCR鉴定、酶切鉴定与基因序列的测定；

步骤三：在步骤二所得重组后的pSC11质粒P11与P7.5两个启动子之间插入限制性内切酶位点；

步骤四：在P11与P7.5两个启动子之间插入TKL的同源序列TKL’；设计引物P-homo-1和P-homo-2，引物两端分别携带有AflII与NheI酶切位点，以p SC11质粒上的TKL序列为模板进行PCR，再利用AflII与NheI两种酶同时酶切步骤三获得的质粒与PCR产物并回收，之后将回收产物利用T4DNA连接酶连接，即得到穿梭质粒载体。

7.权利要求1所述穿梭载体在构建痘苗病毒活载体疫苗的过程中的应用。